Bakterielle Erkennung und Identifizierung mit elektrochemischen Sensoren
Summary
Wir beschreiben einen elektrochemischen Sensor Testverfahren zum schnellen Nachweis von Bakterien und Identifikation. Der Test umfasst eine Sensoranordnung mit DNA-Oligonukleotid-Capture-Sonden für die ribosomale RNA (rRNA) artspezifische Sequenzen funktionalisiert. Sandwich-Hybridisierung der Ziel-rRNA mit dem Capture-Sonde und einem Meerrettichperoxidase-linked DNA-Oligonukleotid Detektorsonde erzeugt eine messbare amperometrischen Strom.
Abstract
Elektrochemische Sensoren sind weit verbreitet für die schnelle und genaue Messung des Blutzuckerspiegels verwendet werden und kann für den Nachweis einer Vielzahl von Analyten angepasst werden. Elektrochemische Sensoren arbeiten nach Transduktion einer biologischen Erkennung Veranstaltung in ein nützliches elektrisches Signal um. Die Signalübertragung erfolgt durch Koppeln der Aktivität eines Redox-Enzym zu einer amperometrischen Elektrode. Sensor Spezifität entweder eine inhärente Eigenschaft des Enzyms Glucoseoxidase bei einer Glucose-Sensor, oder ein Produkt der Verknüpfung zwischen dem Enzym und einem Antikörper oder der Sonde.
Hier beschreiben wir einen elektrochemischen Sensor Assay-Verfahren direkt zu erfassen und zu identifizieren Bakterien. In jedem Fall sind die hier beschriebenen DNA-Sonden-Oligonukleotide. Diese Methode basiert auf Sandwich-Hybridisierung von capture und der Fühler mit Ziel ribosomalen RNA (rRNA) basiert. Die Fänger-Sonde an den Sensor Oberfläche verankert, während der Detektor-Sonde an h gebunden istorseradish Peroxidase (HRP). Wenn ein Substrat, wie 3,3 ', 5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB) mit einer Elektrode mit capture-Ziel-Detektor Komplexe gebunden an dessen Oberfläche zugegeben wird, wird das Substrat durch HRP oxidiert und reduziert durch die Arbeitselektrode. Das Redox-Zyklus führt pendelt der Elektronen durch das Substrat von der Elektrode zum HRP, wodurch Strom in der Elektrode.
Introduction
Mit rRNA als Zielmolekül für bakterielle Nachweis und zur Identifizierung hat eine Reihe von Vorteilen. Die Fülle der rRNA in bakteriellen Zellen sorgt für eine Nachweisgrenze von nur 250 Bakterien pro Milliliter, ohne die Notwendigkeit für Zielamplifikation 1. Bakterielle rRNA enthält eindeutige Spezies-spezifischen Sequenzen, die zugänglich Hybridisierung mit DNA-Sonden sind. Folglich kann eine Anordnung von elektrochemischen Sensoren verwendet werden, um unbekannte Bakterien, wobei jeder Sensor mit einer unterschiedlichen Spezies-spezifische Fangsonde funktionalisierte identifizieren. Positive Control-Sensoren sollten für ein synthetisches Oligonukleotid Ziel, dass "Brücken" die Gefangennahme und der Fühler eine interne Kalibrierung zu erzeugen einbezogen werden.
Elektrochemische Sensoren haben eine breite Palette von Grundlagenforschung und translationale Forschung. Zum Beispiel beschriebene Test hier wurde verwendet, um präzise die Wirkung von E. coli Wachstumsphase auf RRnA und pre-rRNA Kopie Zahlen, die von großem Interesse für die Forscher in der bakteriellen Physiologie 2 interessiert ist. Die Empfindlichkeit des elektrochemischen Sensors Assay wird durch das Signal-Rausch-Verhältnis bestimmt. Eine Vielzahl von Signalverstärkung und Rauschunterdrückung Methoden erforscht worden. Wir finden, dass die Verbesserung der Chemie der Sensoroberfläche Schlüssel zur Verringerung der unspezifischen Bindung von Detektor-Sonde und / oder HRP-Enzym. Insbesondere wurde eine gemischte Monoschicht Alkandithiolen und Mercaptohexanol erwiesen Hintergrund durch Abdecken der Elektrodenoberfläche vollständiger Beibehaltung Zugänglichkeit der Einfang-Sonde für Zielhybridisierung 3 zu reduzieren. Diese Oberflächenchemie Behandlungen sind besonders wichtig für die Assays, die komplexen biologischen Proben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der elektrochemische Sensor beschriebenen Test hier ermöglicht die schnelle Detektion von Nukleinsäure-Targets. Sensitivität und Spezifität hängen teilweise von der freien Energie der Target-Sonden-Hybridisierung, die ihrerseits abhängig von der Länge und GC-Gehalt der Erfassung und der Fühler. Wir üblicherweise die Schritte Hybridisierung bei Raumtemperatur (~ 20 ° C) 5, 6. Jedoch können die Hybridisierung der Schritte (3.2 und 3.3) auch bei höheren Temperaturen in einem Wärmeschrank durchgefüh…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde von Cooperative Agreement Auszeichnung AI075565 (bis DAH) von der National Institute of Allergy and Infectious Diseases und durch die Wendy und Ken Rubin Fund for Excellence in Pediatric Urology Forschung gefördert. BMC ist die Judith und Robert Winston Chair in Pediatric Urology.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 6-mercapto-1-hexanol (MCH) | Sigma | 451088 | Store at room temperature |
| 1,6-hexanedithiol (HDT) | Sigma | H-12005 | Store at room temperature |
| Thiolated capture probes | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Fluorescein-modified detector probes | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Bridging Oligonucleotide | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Anti-Fluorescein-HRP, Fab fragments | Roche | 11 426 346 910 | Store at 4 °C |
| Helios Chip Reader | GeneFluidics | GFR-2009 | |
| Sensor Chip Mount | GeneFluidics | GFR-003 | |
| Film well sticker | GeneFluidics | Shipped with sensor chips | |
| Bare gold 16-sensor array chips | GeneFluidics | SC1000-16X-B | Store in 100% N2 at room temperature |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | Store at 4 °C |
| 1M Phosphate Buffer, pH 7.2 | 0.35M NaH2PO4, 0.65M K2HPO4, adjusted to pH 7.2 | ||
| Blocker Casein in PBS | Pierce | 37528 | Dilute with an equal volume of 1M Phosphate Buffer, pH 7.2, store at 4 °C |
| Table 1. Reagents and Equipment. |
References
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