Denne video præsentation viser en metode til at høste de to vigtigste yderst vaskulære strukturer, der understøtter forhjerne funktion. De er den cerebrale overflade (overfladiske) vaskulatur med tilhørende meninges (MAV) og choroid plexus, som er nødvendige for cerebral blodstrøm og cerebrospinalvæske (CSF) homøostase.
Denne video præsentation blev skabt for at vise en metode til at høste de to vigtigste yderst vaskulære strukturer, der ikke har bopæl i hjernen egentlig, der understøtter forhjerne funktion. De er den cerebrale overflade (overfladiske) vaskulatur med tilhørende meninges (MAV) og choroid plexus, som er nødvendige for cerebral blodstrøm og cerebrospinalvæske (CSF) homøostase. Den høstede væv er egnet til biokemiske og fysiologiske analyser, og MAV har vist sig at være følsomme over for skade produceret af amfetamin og hypertermi 1,2. Samt, er de store og små cerebrale vasculatures høstet i MAV potentielt høje renter, når de efterforsker Concussive typer af hovedtraume. MAV dissekeret i denne præsentation består af pial og nogle af arachnoid membran (mindre dura) i hjernehinden og de store og små cerebral overflade vaskulatur. Plexus chorioideus dissekeret er strukturen, som findes i lateral hjertekamrene som beskrevet af Oldfield og McKinley 3,4,5,6. De anvendte metoder til høstning disse to væv også lette høsten af regionale cortexvæv uden meninges og cerebral større overflade vaskulatur, og er forenelig med høst andre hjernevæv såsom striatum, hypothalamus, hippocampus, etc. dissektion af de to væv tager 5-10 min total. Genekspressionen niveauer for dissekeret MAV og choroid plexus, som vist og beskrevet i denne præsentation kan findes på GSE23093 (MAV) og GSE29733 (choroid plexus) på NCBI GEO repository. Disse data har været, og bliver, bruges til at hjælpe yderligere at forstå funktionen af MAV og choroid plexus, og hvordan neurotoksiske begivenheder såsom svær hypertermi og AMPH påvirker deres funktion.
Tekniske aspekter af MAV og choroid plexus dissektion
Det er kritisk under dissektion af MAV at hjernen "nedsænket" meste af tiden i normalt saltvand eller natrium-phosphatpufret saltopløsning. Tillader MAV og cortex at dehydrere under dissektion vil resultere i MAV klæber tæt til kortikale lag I. Dette vil øge mængden af cortexvæv høstet med MAV og / eller resulterer i manglende evne til at fjerne disse vedhængende MAV sektioner fra cortex. Også, tålmodighed er nødvendig under dissektion. Igen, hvis man møder en vis modstand i fjerne MAV fra cortex i den ene halvkugle under dissektion, skifte til den anden halvkugle og gå tilbage senere til den side, hvor modstanden var stødt på. Denne metode tager nogle praksis at perfekt og kræver omkring 5 til 15 "praksis" dissektioner før en konsekvent ensartet høst af MAV væv opnås. Metoden til at starte dissektion og removal af MAV ved det arterielle cirkel i bunden af hjernen letter fjernelsen af meninges ved at bruge større vaskulaturen support "stillads".
En stor del af blodet oprindeligt i MAV vaskulatur efter aflivning skal udstødes under dissektion, og mindre end 5% af RNA høstet fra MAV bør være af blod oprindelse. Det er muligt at fjerne næsten alt det blod ved perfusion af dyret med 50 til 70 ml saltvand under anvendelse af histologiske teknikker, før halshugning og hjernen fjernes. Det er imidlertid så meget vanskeligere at visualisere de MAV væv under dissektion. De tre mest sandsynlige kilder til "kontaminering" af MAV væv er pinealkirtlen, kortikale lag I væv og resterende lugtekolben væv, men det er også muligt at få hypofysen væv i præparatet. Pineal kontaminering i MAV detekteres af MAV indeholder en rund 1-2 mm i diameter kugle, der er farvet mørk rød. Den primære funktionaf pinealkirtlen anses normalt for at være helt forskellig fra MAV. Den primære funktion er at producere melatonin, som regulerer aspekter af den cirkadiske rytme 9, og i lipoxygenation 10 i lipid-prækursorer. Selvom gen Lox, som regulerer lipoxygenaseaktivitet, blev anset for at være til stede hos voksne primært i pinealkirtlen 10, vores resultater viser, at det også er konstant til stede på signifikante niveauer i MAV. Resterende corticale eller lugtekolben kontaminering resulterer i rosa banelignende MAV væv med omkring 1 til 2 mm tættere væv, der er meget blegere i farven indeholdt deri. Dette kan afsløres ved "flydende" MAV på overfladen af bufferen, og derefter fjerne de tungere corticale eller pære væv anvendelse af de to dissekere pincet.
Hvis forurening af MAV fra kortikale lag I væv, hypothalamisk væv eller pinealkirtlen er til stede, derefter adskillige gener vil have en betysentligt større ekspression end hvad der er normalt til stede i en "ren" dissektion. Forurening af MAV med pinealkirtlen vil resultere i højere ekspression af arylalkylamin-N-acetyltransferase (AANAT), som er nødvendig for melatonin syntese. Desværre, hvis pineal kontaminering forekommer under MAV dissektion, vil niveauerne af Lox i MAV ikke kunne bestemmes nøjagtigt. Forurening af MAV med cortexvæv vil resultere i højere ekspression af neuron-specifikke gener, såsom hippocalcin (Hpca), parvalbumin (Pvalb) og / eller neuronal pentraxin receptor (Nptxr). Forurening af MAV med hypothalamus væv vil resultere i højere ekspression af væksthormon 1 (GH1), proopiomelanocortin (POMC). I tilfælde af at en vis kontaminering eksisterer i de indsamlede væv, kan de fleste af disse gener, identificeres og ikke anvendes i genekspressionsanalyse. Dette er særlig vigtigt for gener, der findes i cirkulerende blood der stadig kan være til stede i MAV eller choroid plexus.
Interpretting genekspression data fra høstet MAV og choroid plexus
Cerebral overflade (overfladiske) vaskulatur med tilhørende meninges (MAV) og plexus chorioideus er nødvendige for cerebral blodstrøm og cerebrospinalvæske (CSF) homeostase 4,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. Vævet høst er egnet til biokemiske og fysiologiske analyser, og MAV har vist sig at være følsomme over for skade produceret af amfetamin og hypertermi 1,2 gennem genekspressionsanalyse. Disse resultater står i forhold til, hvad der også er kendt om alvorlig hypertermi og eksponering for amfetaminer til hjernen vaskulatur i almindelighed 18,19,20. Humane kliniske data understøtter troen på, at subduralt vaskulatur er følsom over for skader af amfetamin og metamfetamin 21,22. Samt, herun de store og små cerebrale vasculaturesING dem i pial lag af meninges, der er høstet i MAV har potentielt stor interesse, når de efterforsker Concussive typer af hovedtraume 23,24 25. Den nuværende genekspression profil gav fra MAV viser, at pial og eventuelt araknoid meningeal membraner kan spille en større rolle end forventet i reguleringen CSF sammensætning. I fremtiden, ved anvendelse af dissektionsmikroskop teknikker kan det være muligt yderligere at separere væv, som omfatter MAV således at pial og arachnoid membraner kan adskilles fra den større arterielle vaskulatur til stede og muligvis fra hinanden. Dette vil give et bedre fortolkning af funktionen af hver af disse tre komponenter af det høstede MAV.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af NCTR / FDA.
Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Normal Saline (9 grams saline/ 1 Liter H2O) | In-house | Dissection buffer | |
0.1 M Sodium Phosphate pH 7.4 | In-house | Dissection buffer | |
Bone Rongeurs | Roboz | RS-8300 | Skull bone removal |
Forceps-bent tip (4″ long & 0.8 mm wide tip) | Roboz | RS-5135 or RS-5137 | Dissecting forceps |
Forceps-straight tip (5.5″ long ) | Roboz | RS-8124 or RS-8104 | Thumb Dressing forceps |