Erfolgreicher Einsatz von Zell-Tracking Farbstoffe Immunzellfunktion und Proliferation zu überwachen umfasst mehrere wichtige Schritte. Wir beschreiben Methoden zur: 1) Erhalten hell, einheitliche, reproduzierbare Label-ten mit Membran Farbstoffe; 2) Auswählen Fluorochrome und Datenerfassung Bedingungen, und 3) der Auswahl eines Modells, die Zellproliferation auf Farbstoffdilution zu quantifizieren.
Fluoreszierende Zelle Tracking Farbstoffe in Kombination mit Durchfluss-und Bildzytometrie, sind leistungsfähige Werkzeuge, mit denen die Interaktionen und Schicksale verschiedener Zelltypen in vitro und in vivo zu studieren. 1-5 Obwohl es buchstäblich Tausende von Publikationen mit solchen Farbstoffen, einige die am häufigsten auftretenden Zell-Tracking-Anwendungen sind die Überwachung von:
Kommerziell erhältliche Zelle Tracking Farbstoffe weisen in Bezug Chemien und Fluoreszenzeigenschaften aber die große Mehrheit fallen in eine von zwei Klassen auf ihren Mechanismus Zellmarkierung basiert. "Membrane Farbstoffe", verkörpert durch PKH26 sind stark lipophile Farbstoffe tHut Partition stabil, aber nicht kovalent in Zellmembranen 1,2,11. "Protein-Farbstoffe", verkörpert durch CFSE, sind Amino-Reaktivfarbstoffen, die stabile kovalente Bindungen mit Zellproteinen 4,16,18. Jede Klasse hat ihre eigenen Vor-und Nachteile. Der Schlüssel zu ihrem erfolgreichen Einsatz, vor allem in multicolor Studien, in denen mehrere Farbstoffe verwendet werden, um verschiedene Zelltypen zu verfolgen, ist es daher, die kritischen Fragen, die optimale Nutzung der einzelnen Klassen 2-4,16,18,24 verstehen.
Die Protokolle, die hier hervorzuheben drei häufigsten Ursachen für schlechte oder variable Ergebnisse bei der Verwendung von Zell-Tracking Farbstoffe. Diese sind:
Hier genannten Beispiele veranschaulichen, wie diese Größen beeinflussen Ergebnisse bei Verwendung Membran und / oder Protein-Farbstoffe, die Zellproliferation zu überwachen.
Die hier beschriebenen Methoden sind diejenigen in unserer gemeinsamen Labors gefunden, die meisten sicher geben, optimale Ergebnisse für hPBMC Kennzeichnung mit Membran Farbstoffe 13,16,18 und Lymphozyten Untergruppe Phänotypisierung und Proliferation Tracking entweder mit Membran-oder Protein-Farbstoffe 2,11,13,16, 18. Wie de den 1 und 2 dargestellt ist, ist hell einheitliche Kennzeichnung am leichtesten durch Begrenzung des Gehalts physiologische Salze und unter Verwendung eines Misch-Technik erreicht, dass zusätzlich eine schnelle, homogene Belichtung aller Zellen auf die gleiche Konzentration an Farbstoff. Weil Färbung mit Farbstoffen erfolgt Membran durch Partitionieren in die Lipid-Doppelschicht, können andere Variablen, die frei verändern Farbstoffkonzentration auch Auswirkungen Markierungseffizienz. Zum Beispiel die Kennzeichnung mit rundem Boden Polystyrolröhrchen Ergebnisse in weniger effizient Auswaschung von Salzen vor Resuspension in Diluent C und auch in reduzierten freien Farbstoffkonzentration durch Adsorption an Rohrwänden färben, insbesonderebei niedrigeren Farbstoffkonzentrationen. Beide Faktoren tendenziell breitere Färbung Distributionen, als wenn die Kennzeichnung erfolgt mit konischen Boden Polypropylenröhrchen (Abbildungen 3, 4 und geben unveröffentlichte Ergebnisse). Probe Alter und Art kann auch Auswirkungen Peakbreite selbst wenn optimierten Färbeverfahren verwendet werden. Zum Beispiel Lebensläufe PKH26 pos Lymphozyten aus frisch entnommenem Blut reichen von 14-20% (Abbildung 3, Nr. 13 und unveröffentlichte Ergebnisse), während Lebensläufe Lymphozyten von 24 Stunden alten Blutproben oder TRIMA Pherese Filter-Bereich isoliert 25 bis 30 % (Abbildung 4 und Nr. 18).
Färbung Einheitlichkeit und das Ausmaß, in dem sie nicht lebensfähige Zellen von der Analyse ausgeschlossen werden kann sowohl Einfluss darauf, ob unterscheidbare Tochter Gipfel zeigt sich in der Farbstoffdilution Profil, was sich wiederum auf Wahl eines Verbreitung Modell, um die beobachteten Daten (Abbildungen 5 und 6 passen </strong>). Obwohl ModFit (Verity Software House, Topsham, ME) wird hier als ein Beispiel verwendet werden, um Software-Metriken wie Proliferationsindex und Zwischenprodukt Frequenz (Figuren 3, 5 und 6; Tabelle 3) zu erzeugen verwendet, andere Software-Module Pakete enthalten, zu analysieren Proliferation Daten. Dazu gehören FCSExpress (De Novo Software, Los Angeles, CA) und FlowJo (Baum Star, Inc., Ashland, OR). Alle diese Programme verwenden eine nicht-lineare Analyse der kleinsten Quadrate, iterativ zu finden die beste Anpassung an den Rohdaten durch Veränderung der Position, Höhe und SD (oder Breite) der Gauß-Peaks, welche sequentielle Tochter Generationen. Proliferativen Index (PI) und Precursor Frequency (PF) sind die am häufigsten verwendeten Maßnahmen Ausmaß der Proliferation. PI, wie durch ModFit definiert ist, ist ein Maß für die Zunahme der Zellzahl im Verlauf des Assays, analog zu den "Stimulationsindex 'eines Thymidinaufnahme Assay. PF gibt den Anteil der Zellen in der anfänglichen populatIonen, die auf den Stimulus von proliferierenden reagiert. Vorsicht ist geboten, aber beim Lesen der Literatur seit Terminologie variiert etwas zwischen den Software-Paketen (zB FlowJo und ModFit verwenden unterschiedliche Definitionen und Berechnungen für das, was durch die "Proliferation Index" gemeint) 22.
Die kritischen Fragen hier für die Kennzeichnung und die Proliferation Analyse mit Membran Farbstoffe diskutiert werden auch auftreten, wenn unter Verwendung von Protein-Farbstoffe. Zum Beispiel muss sorgfältig auf Mischtechnik auch beobachtet, zusammen mit Ausschluss tot / sterbenden Zellen werden, um eine gleichmäßige Verteilung und unterscheidbar Tochter Peaks erhalten bei Verwendung CFSE (Abbildung 6) 2-4,13,18,24. Geeignete Wahl der Fluorochrome zur Phänotypisierung und Rentabilitätsprüfung ist auch wichtig zu übermäßigen spektrale Überlappung und die Unfähigkeit, Antikörper positiv Zellen erkennen zu vermeiden, insbesondere mit sichtbarem emittierenden Protein Farbstoffe wie CFSE 2-4,11,13,16,18 </sup>. Verminderung der Konzentration von Tracking Farbstoff vermindert die Kompensation Probleme in benachbarten spektralen Kanälen, sondern begrenzt auch die Anzahl der Zellteilungen, die überwacht werden können, bevor Tochterzelle Intensitäten mit Autofluoreszenz überschneiden beginnen. Alternativ können Sie auch neuere Zellen Tracking Farbstoffe wie weit rot emittierenden CellVue Claret (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) oder violett emittierenden CellTrace Violet (Life Technologies, Grand Island, NY) kann die Entschädigung Probleme (Abbildung 6) zu reduzieren. Schließlich, obwohl Farbstoffe Membran allgemein geringere Toxizität aufweisen 11,26 neigen, ist es möglich, über-Label-Zellen mit entweder Klasse von Farbstoff. Daher ist es immer notwendig, zu überprüfen, dass die Konzentration von Tracking verwendete Farbstoff wurde nicht die Funktionalität der Zellen verfolgt werden (Abbildung 6) 3,13,16,18 verändert.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren möchte besonders den folgenden Personen für ihre technischen und intellektuellen Beiträge zur Entwicklung dieser Methoden im Laufe der Jahre danken: Bruce Bagwell (Verity Software House), Nadège Bercovici (IDM), Lizanne Breslin (Zynaxis Cell Science und PTI Research) , Brian Gray (PTI Research), Jan Fisher (Dartmouth Medical School), Alice Givan (Dartmouth Medical School), Betsy Ohlsson-Wilhelm (SciGro, Inc.), und Mary Waugh (Dartmouth Medical School). Sie würden auch gerne die Bowdoin Klasse von 2006 aus den jährlichen Kurse in Forschung Methoden und Anwendungen der Durchflusszytometrie, die die Daten in Abbildung 2 dargestellt generiert danken.
Durchflusszytometrie wurde am Roswell Park Cancer Institute Durchflusszytometrie Laboratory, die zum Teil durch Geräte Zuschüsse aus dem NIH Gemeinsame Instrument Programm wurde durchgeführt, und erhält Unterstützung von der Core-Stipendium (5 P30 CA016056-29) von der NationalCancer Institute der Roswell Park Cancer Institute und an der Abramson Cancer Center Durchflusszytometrie und Zellsortierung Ressource Laboratory der University of Pennsylvania, die zum Teil von Geräten Zuschüsse aus dem NIH Gemeinsame Instrument Program wurde gegründet und erhält Unterstützung von NIH # 2P30 CA016520 vom National Cancer Institute. Die Arbeit in den Abbildungen 3 und 5 gezeigt wurde teilweise auch durch SBIR Zuschuss EB00228 unterstützt von den National Institutes of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) verliehen PTI Research, Inc.
Reagent or equipment | Company | Catalogue number | Comments |
Commercially Purchased | |||
7-Aminoactinomycin D | Sigma-Aldrich | A9400 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
Hanks balanced salt solution (HBSS) | Life Technologies | 14175-079 | Calcium and magnesium free, without phenol red |
Human IgG Cohn fraction II and III globulins | Sigma-Aldrich | G-4386 | |
Mouse anti-human CD3-FITC | BD Biosciences | 349201 | Saturating concentration as determined by laboratory titration |
Mouse anti-human CD4-APC | BD Biosciences | 340672 | Saturating concentration as determined by laboratory titration |
Mouse anti-human CD4-PECy7 | BD Biosciences | 348799 | Saturating concentration as determined by laboratory titration |
Mouse anti-human CD8-FITC | BD Biosciences | 347313 | Saturating concentration as determined by laboratory titration |
Mouse anti-human CD8-APC | Caltag (Life Technologies) | MHCD0805 | Saturating concentration as determined by laboratory titration |
Mouse anti-human CD19-APC | Caltag (Life Technologies) | MHCD1905 | Saturating concentration as determined by laboratory titration |
Mouse anti-human CD25-APC | BD Biosciences | 340938 | Saturating concentration as determined by laboratory titration |
Mouse anti-human CD127-PE | BD Biosciences | 557938 | Saturating concentration as determined by laboratory titration |
Mouse anti-human CD3 | eBiosciences | 16-0037-85 | 1.0 mg/ml; azide free |
Mouse anti-human CD28 | eBiosciences | 16-0289-85 | 1.0 mg/ml; azide free |
PBS | Gibco | 21300-058 | |
PKH26 red fluorescent cell linker kit containing 10-3M PKH26 in EtOH and Diluent C | Sigma-Aldrich | PKH26GL-1KT or MINI26-1KT |
Procedures in Step 1 also apply to kits containing PKH67 or other CellVue dyes |
CellVue Claret far red fluorescent cell linker kit containing 10-3M CellVue Claret in EtOH and Diluent C | Sigma-Aldrich | MINCLARET-1KT or MIDCLARET-1KT | |
5-(and-6)-carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester (CFDA-SE) | Invitrogen (Life Technologies) | C34554 | Non-fluorescent; cleaved by membrane esterases to form fluorescent amino-reactive carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) |
LIVE/DEAD Fixable Violet | Invitrogen (Life Technologies) | L34955 | |
Sterile 12 x 75 mm conical polypropylene tubes & caps |
VWR | 60818-102 | Gives better membrane dye staining efficiency (reduced dye adsorption; less cell loss during supernatant aspiration) |
12 x 75 mm round bottom polystyrene tubes |
Becton Dickinson | 21008-936 | |
Flow cytometer | BD Bioscience | FACSCalibur LSRFortessa |
Any cytometer able to detect FITC, PKH26, and 7-AAD (ex. 488 nm; em. 520 nm, 567 nm, and 655 nm, respectively) and APC ex. 633-640 nm; em. 660 nm) |
Flow cytometer | Beckman Coulter | LSRII CyAn | Any cytometer able to detect FITC, PKH26, and 7-AAD (ex. 488 nm; em. 520 nm, 567 nm, and 655 nm, respectively) and APC ex. 633-640 nm; em. 660 nm) |
Laboratory Prepared | |||
7-Aminoactinomycin D, concentrated stock |
NA | NA | 1 mg/ml in PBS. Freeze in aliquots and store at -20 °C. |
7-Aminoactinomycin D, working stock |
NA | NA | 100 μg/ml in PBS; prepare daily from 1 mg/ml frozen stock. |
IgG block | NA | NA | HBSS + 10 mg/ml Human IgG Cohn fraction II and III globulins + 10 mg/ml BSA. |