सेल डिवीजन ट्रैकिंग सेल रंजक का उपयोग करने की निगरानी के लिए अनुकूलित धुंधला और प्रसार मॉडलिंग तरीकों

Summary

सेल ट्रैकिंग रंगों के सफल उपयोग करने के लिए प्रतिरक्षा सेल समारोह और प्रसार पर नजर रखने के लिए कई महत्वपूर्ण कदम शामिल है. हम के लिए विधियों का वर्णन: 1) उज्ज्वल, वर्दी, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य झिल्ली रंगों के साथ लेबल आईएनजी प्राप्त करने, 2) fluorochromes और डाटा अधिग्रहण शर्तों का चयन, और 3) के लिए सेल डाई कमजोर पड़ने के आधार पर प्रसार यों के लिए एक मॉडल का चयन.

Abstract

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.^1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:

1. stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation^6-8
2. antigen-driven membrane transfer⁹ and/or precursor cell proliferation^3,4,10-18 and
3. immune regulatory and effector cell function^1,18-21.

Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. “Membrane dyes”, typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes^1,2,11. “Protein dyes”, typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins^4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class^2-4,16,18,24.

The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:

1. Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.
2. Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 10² – 10³ times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.
3. Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.

Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Protocol

1. जनरल झिल्ली लेबल PKH26 सेल ट्रैकिंग डाई के साथ (25 संदर्भ, 1 चित्रा) 1.9 – 1.1 कदम के लिए बाँझ तकनीक का प्रयोग करें. ~ 10 7 मानव परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं या लिम्फोसाइटों (hPBMC, hPBL) एक अंतिम 300 XG स्पिन के अलावा के साथ प्रयोगशाला के मानक विधि का उपयोग करने के लिए प्लेटलेट संदूषण को कम तैयार है. 10 7 HbSS 1% और बर्फ पर BSA जगह में मिलीग्राम / कोशिकाओं Resuspend, चरण 2 में उपयोग के लिए 500 μl अशेष भाजक (5×10 6 कोशिकाओं) आरक्षित. जगह एक 12 x 75 मिमी शंक्वाकार polypropylene ट्यूब में 5×10 6 कोशिकाओं (500 μl). 3.5 मिलीग्राम HbSS के साथ एक बार धो लें. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला aspirate, अवशिष्ट तरल पदार्थ के 15-25 से अधिक नहीं μl छोड़ रहा है, लेकिन देखभाल करने के लिए कोशिकाओं को नहीं निकाल. इस ट्यूब का उपयोग करने के लिए 1.4 चरण में एक 2x सेल निलंबन को तैयार करने के लिए. सेल 1.2 चरण धोने के दौरान एक 12 x 75 मिमी शंक्वाकार polypropylene ट्यूब तनुकारक (वस्तु) सी लेबलिंग वाहन के 0.5 मिलीलीटर () PKH26GL किट से जोड़ने. तैयार करने के लिए इस ट्यूब का प्रयोग करें1.5 चरण में एक 2x PKH26 समाधान कर रहे हैं. 1.2 कदम से धोया सेल गोली तनुकारक (वस्तु) सी लेबलिंग वाहन के 0.5 मिलीग्राम और aspirate और 3-4 बार वितरित करने के लिए एक एकल कक्ष निलंबन (2x कोशिकाओं) प्राप्त करने के. बुलबुला गठन और अत्यधिक मिश्रण से बचने के लिए है, जो सेल व्यवहार्यता और वसूली को कम कर सकते हैं. 1.4 चरण में 2x सेल निलंबन की तैयारी के तुरंत बाद, तनुकारक (वस्तु) सी 1.3 कदम और भंवर में तैयार ट्यूब 1.0 मिमी PKH26 इथेनॉल में डाई स्टॉक (PKH26GL किट से) के 2.0 μl जोड़कर एक 2x (4 सुक्ष्ममापी) डाई समाधान तैयार समान रूप से फैलाने के. 1.5 चरण में 2x डाई समाधान की तैयारी के तुरंत बाद, तेजी से 2x डाई समाधान में 1.4 चरण से 2x सेल निलंबन विंदुक और साथ ही aspirate और 3-4 बार वितरित करने के लिए पूरी तरह से रंग में कोशिकाओं को फैलाने मत: 1.0 मिमी डाई सीधे जोड़ कोशिकाओं, 2x डाई में 2x कोशिकाओं डालना, या 2x कोशिकाओं को जोड़ने के लिए डाई 2x जबकि vortexing. क्योंकि धुंधला हो जाना लगभग तात्कालिक है, इस तरह के तरीकों को कम उपजअनुशंसित विधि की तुलना में समान तीव्रता (2 चित्रा). 1 मिनट के बाद, गर्मी निष्क्रिय सीरम या HbSS 5% कोशिका झिल्ली में डाई तेज रोकने BSA 1.0 मिलीलीटर जोड़ने. पर्याप्त प्रोटीन का उपयोग करने में विफलता जो वाशिंग चरणों के दौरान कोशिकाओं के साथ गोली और अन्य कोशिकाओं की अनपेक्षित लेबलिंग पैदा कर सकता है एक प्रयोग में मौजूद डाई समुच्चय, के गठन के जोखिम. यदि 10% निष्क्रिय गर्मी (मुख्यमंत्री) सीरम या HbSS 1% BSA के साथ मध्यम बंद अभिकर्मक के रूप में इस्तेमाल किया जा रहा है, बाहर ले जाने के एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार polypropylene ट्यूब में धुंधला और बंद अभिकर्मक के कम से कम 5.0 मिलीलीटर जोड़ने के लिए सभी के सोखना बीमा अनिगमित डाई. 5 मिनट के लिए लेबल की कोशिकाओं अपकेंद्रित्र @ 400 ~ x जी. कोशिकाओं को हटाने के बिना ध्यान से सतह पर तैरनेवाला aspirate. गोली दो बार मुख्यमंत्री या HbSS 1% BSA के 4 मिलीलीटर के साथ, धो recentrifugation से पहले अच्छी तरह से गोली dispersing. ट्यूब दीवारों पर adsorbed डाई का भार कम करने के लिए और कपड़े धोने की क्षमता को अधिकतम करने के लिए, फाई बाद एक ताजा polypropylene ट्यूब कोशिकाओं हस्तांतरणrst resuspension. नोट: पर्याप्त रूप से दाग कोशिकाओं गोली में एक अलग गुलाबी रंगत प्रदर्शन करेंगे. 1.0 मिलीलीटर HbSS 1% BSA में धोया सेल गोली Resuspend. कोशिकाओं की गिनती, सेल वसूली निर्धारित करते हैं, और मात्रा को समायोजित करने के लिए 10 7 मिलीग्राम / एक अंतिम एकाग्रता दे. सावधान आकांक्षा के साथ, सेल वसूली ≥ 85% होना चाहिए. यदि सेल वसूली <70% है, तो आगे बढ़ने से पहले कारण निर्धारित. एक 150 μl (1.5×10 6 कोशिकाओं) और 2 चरण में उपयोग के लिए बर्फ पर अशेष भाजक जगह वापस ले लें. 2. साधन और परख सेटअप नियंत्रण की तैयारी (1 टेबल) 1, 3, 4, 5, और 7: अशेष भाजक सेल पाँच 1.8 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूबों के प्रत्येक में 1.1 चरण में बचाया निलंबन से अस्थिर कोशिकाओं के 50 μl (5 5×10). 2, 6 और 8: अशेष भाजक 1.9 कदम से तीन ट्यूबों के प्रत्येक में PKH26 स्थिति कोशिकाओं की 50 μl (5 5×10). 1-8 ट्यूब्स, 10 μl आईजीजी ब्लॉक (तालिका देखें अभिकर्मकों के को आईजीजी की 100 ग्राम / ट्यूब) जोड़ेंऔर परिवेश के तापमान (20-25 डिग्री सेल्सियस) पर 10 मिनट के लिए सेते हैं. एंटीबॉडी का एक saturating राशि (ies) ट्यूब्स 4, 5, 7 1 तालिका में संकेत दिया है, और 8 जोडें और परिवेश के तापमान पर 30 मिनट और प्रकाश से रक्षा के लिए सभी नमूने (1-8 ट्यूब) सेते हैं. सभी नमूनों में HbSS 1% BSA के 1.5 मिलीलीटर जोड़ें, गोली (5 मिनट 400 @ XG) centrifugation और HbSS 1% BSA के 1.5 मिलीलीटर के साथ एक बार सावधान आकांक्षा के साथ, धोने से कोशिकाओं सेल नुकसान से बचने के लिए. HbSS 1% BSA के 500 μl में प्रत्येक नमूना Resuspend. यदि अपने cytometer पर विश्लेषण किया जा नमूनों के लिए आवश्यक है, एक 12 x 75 मिमी दौर नीचे ट्यूब हस्तांतरण. ट्यूबें 3, 6, 7 और 8 के 100 छ / 7 AAD मिलीलीटर दैनिक काम स्टॉक (अभिकर्मकों की तालिका देखें) के 10 μl जोड़ें तालिका 1 में संकेत के रूप में. 30 मिनट पूर्व प्रवाह cytometer सेटअप और धुंधला सत्यापन (3 चरण) में उपयोग करने के लिए बर्फ पर सेते हैं. 3. प्रवाह cytometer सेटअप और धुंधला सत्यापन सत्यापित करें कि प्रवाह cytomeआतंकवाद ठीक से काम कर रहा है, दैनिक गुणवत्ता नियंत्रण के लिए प्रयोगशाला की स्थापना की प्रक्रिया का उपयोग. सत्यापित करें कि संकेतों प्रत्येक वर्णक्रमीय करने के लिए इस्तेमाल किया जा विंडो में आसानी से पता लगाया जा सकता है हो सकता है, और है कि डिटेक्टर प्रतिक्रियाओं रैखिक विंडो में तीव्रता प्रसार 14 की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जा संकेत आनुपातिक हैं. FSC बनाम 1 ट्यूब के लिए एसएससी डेटा मोल रैखिक प्रदर्शन तराजू का उपयोग. लिम्फोसाइट आबादी डॉट साजिश के निचले बाएँ चक्र में गिर जाता है कि इस तरह के प्रत्येक डिटेक्टर प्रवर्धन समायोजित, या तो पैरामीटर में बंद पैमाने पर नहीं है, है और बाधित thresholding के कारण नहीं है. 3.7-3.3 चरणों में सभी नमूनों के लिए ungated FSC बनाम एसएससी डेटा ले लीजिए. 1 ट्यूब के लिए डेटा प्राप्त करने के लिए, कोई रंग और सभी 4 प्रतिदीप्ति डिटेक्टरों के लिए मुआवजा logarithmic प्रदर्शन तराजू का उपयोग. प्रत्येक डिटेक्टर उच्च वोल्टेज (एचवी) को समायोजित करने के लिए बड़े पैमाने पर कुछ / कोई कोशिकाओं को 1 चैनल में जमते के साथ अस्थिर लिम्फोसाइटों के autofluorescence जगह. प्रत्येक हिस्टोग्राम के लिए एक विश्लेषण सीमा निर्धारितप्रतिभाशाली अस्थिर कोशिकाओं के 2% करने के लिए इसी. कोई रंग मुआवजा और HV कदम 3.2 और 3.3 में स्थापित सेटिंग्स का उपयोग, 2 ट्यूब के लिए डेटा प्राप्त, FSC, एसएससी और सभी 4 प्रतिदीप्ति डिटेक्टरों में संकेतों का संग्रह. प्रतिदीप्ति PKH26 पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया डिटेक्टर के लिए सत्यापित करें कि सभी PKH26 स्थिति कोशिकाओं 3 Rd -4 वें दशक में एक एकल सममित चोटी के रूप में बड़े पैमाने पर दिखाई देते हैं, कुछ / पिछले चैनल में कोई कोशिकाओं के साथ. अगर वहाँ कई चोटियों हैं या चोटी आकार विषम है, सावधान ध्यान के साथ चरण 1 दोहराने के लिए न्यूनीकरण और नमक के मिश्रण तकनीक (2 चित्रा). यदि आवश्यक हो, डाई एकाग्रता समायोजित करें. 3.3 चरण में स्थापित सेटिंग्स का उपयोग, 3 ट्यूब के लिए डेटा प्राप्त, FSC, एसएससी और सभी 4 प्रतिदीप्ति डिटेक्टरों में संकेतों का संग्रह. डिटेक्टर के लिए 7-AAD प्रतिदीप्ति पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया, सत्यापित करें कि 7 AAD स्थिति कोशिकाओं को 2% 3.3 चरण में स्थापित सीमा (यानी, कि अलाभकारी कोशिकाओं को अच्छी तरह से हल कर रहे हैं के ऊपर गिरव्यवहार्य 7-AAD neg कोशिकाओं से). 3.3 चरण में स्थापित सेटिंग्स का उपयोग, 4 ट्यूब के लिए डेटा प्राप्त, FSC, एसएससी और सभी 4 प्रतिदीप्ति डिटेक्टरों में संकेतों का संग्रह. सत्यापित करें कि CD8 स्थिति कोशिकाओं को अच्छी तरह से अस्थिर कोशिकाओं (यानी, 2% FITC डिटेक्टर के लिए 3.3 चरण में स्थापित सीमा के ऊपर गिर) से हल कर रहे हैं. 5 ट्यूब के साथ दोहराएँ और सत्यापित करें कि CD8 स्थिति कोशिकाओं को अच्छी तरह से अस्थिर कोशिकाओं (यानी 2% गिरावट APC डिटेक्टर के लिए 3.3 चरण में स्थापित सीमा से ऊपर) से हल कर रहे हैं. 3.3 चरण में स्थापित सेटिंग्स का उपयोग करना, ट्यूबों 6, 7 और 8 के लिए डेटा प्राप्त, FSC, एसएससी और सभी 4 प्रतिदीप्ति डिटेक्टरों में संकेतों का संग्रह. सूची मोड 1-5 ट्यूब और अपने रंग क्षतिपूर्ति करने के लिए एक रंग की स्थापना के लिए तीन अन्य fluorochromes पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है डिटेक्टरों में प्रत्येक fluorochrome मैट्रिक्स ओवरलैप सॉफ्टवेयर के लिए एकत्र फ़ाइलों का उपयोग करें. 6 नमूना के लिए सूची मोड फ़ाइल इस मैट्रिक्स को लागू करें और सत्यापित करें कि प्रयोगशाला की उपस्थिति PKH26Eling 7-AAD स्थिति कोशिकाओं का पता लगाने की क्षमता में परिवर्तन नहीं करता. 3) एक अच्छी तरह से हल subpopulations (CD3 neg neg CD4, CD3 स्थिति CD4 neg और CD3 स्थिति CD4 स्थिति) एक बनाम FITC पर पहचाना जा सकता: 3.8 कदम से रंग मैट्रिक्स ओवरलैप 7 नमूना के लिए सूची मोड फ़ाइल और सत्यापित करें कि लागू APC डॉट साजिश, और ख) की उपस्थिति विरोधी CD3 FITC और विरोधी CD4-APC 7 AAD स्थिति कोशिकाओं का पता लगाने की क्षमता में परिवर्तन नहीं करता है. यदि विरोधी CD3 FITC की उपस्थिति PKH26 डिटेक्टर पर एकत्र किए गए आंकड़ों के लिए ऊपरी सीमा 2% बदल, सीमा के रूप में आवश्यक रद्दोबदल. रंग ओवरलैप 3.8 कदम से 8 नमूने के लिए सूची मोड फ़ाइल मैट्रिक्स लागू. यदि PKH26 लेबलिंग की उपस्थिति उन 3.3 चरण में autofluorescence नियंत्रण का उपयोग कर सेट से FITC, 7-AAD या APC डिटेक्टरों के लिए 2% की सीमा बदल, तालिका 1 की 7 ट्यूब का उपयोग जरूरत के रूप में सीमा (ies) रद्दोबदल और सत्यापित करने के लिए यह है कि disting करने के लिए अभी भी है संभवuish CD3 स्थिति CD4 स्थिति, CD3 स्थिति CD4 neg, और CD3 neg CD4 neg कोशिकाओं समायोजित सीमा (ies) का उपयोग. 4. डाई कमजोर पड़ने से कोशिका विभाजन की निगरानी के लिए परमाणु अप्रसार मॉडल चयन पीढ़ियों जो चैनलों और अपने कोशिकामापी पर लघुगणक दशकों की संख्या पर निर्भर करता है के बीच अंतर का निर्धारण करते हैं. डिजिटल उपकरणों के लिए, यह मान, आम तौर पर 4 या 5 दशकों, डिजिटल सिग्नल प्रोसेसर में डिब्बे की संख्या द्वारा निर्धारित किया जाता है. अनुरूप उपकरणों पर, जहां दशकों की संख्या शायद ही कभी एक पूरी संख्या है, सटीक मॉडलिंग प्रयोगात्मक निर्धारित दशकों की सटीक संख्या की आवश्यकता है. ऐसा करने के लिए, निर्माता सौंपा रिश्तेदार तीव्रता के साथ calibrated फ्लोरोसेंट मोती का एक मिश्रण से डेटा उसी डिटेक्टर उच्च वोल्टेज प्रयोग में इस्तेमाल किया सेटिंग्स पर अधिग्रहण कर लिया है. मनका चोटियों की स्थिति int के मामले में लघुगणकीय पैमाने के अंशांकन के लिए अनुमति देता हैलॉग प्रति दशक ensity रेंज. विशेष रूप से, यह निर्माता सौंपा मूल्य के प्रवेश के खिलाफ प्रत्येक मनका प्रकार के लिए चैनल की संख्या की साजिश रचने के द्वारा किया जाता है. मनका डेटा मूल्यों के लिए एक सबसे अच्छा फिट सीधी रेखा के ढलान प्रति चैनल रिश्तेदार तीव्रता इकाइयों की संख्या देता है. चैनलों की संख्या से गुणा है, तो यह मान तो पूर्ण पैमाने के लिए लॉग दशकों की संख्या, जो तीव्रता में कमी दो गुना (यानी, बेटी पीढ़ी दूरी) इसी चैनलों की संख्या 14 से गणना की जा सकती हो जाएगा. तय है कि पीढ़ियों के बीच एक निश्चित रिक्ति का उपयोग करने के लिए या अंतर फ्लोट करने की अनुमति. एक मानक सेटिंग (निर्धारित) पीढ़ीगत रिक्ति 4.5 चरण में निर्धारित मूल्य के हर पीढ़ी के स्थान आवंटित करने का उपयोग करने के लिए, और आमतौर पर इस्तेमाल किया जाता है जब हिस्टोग्राम अलग चोटियों का अभाव है. एक नाव सेटिंग प्रत्येक पीढ़ीगत चरम स्थिति हिस्टोग्राम आकार के द्वारा निर्धारित किया जा करने की अनुमति देता है और आमतौर पर इस्तेमाल किया जाता distinguishabl जबई पीढ़ीगत चोटियों स्पष्ट कर रहे हैं. तय है कि सभी पीढ़ियों या एक अस्थायी चौड़ाई के लिए एक निश्चित चोटी चौड़ाई का उपयोग करने के लिए. एक निश्चित चौड़ाई unstimulated नियंत्रण नमूना के लिए उपयोग करता है एसडी गणना सभी पीढ़ियों के मॉडल और आम तौर पर करने के लिए चुना है जब नमूना वर्गो में विभाजनीय पीढ़ीगत चोटियों का अभाव है. एक अस्थायी चौड़ाई कार्यक्रम हर पीढ़ी के लिए स्वतंत्र रूप से करने के लिए एसडी भिन्न हो के लिए अनुमति देता है और है सर्वश्रेष्ठ वर्गो में विभाजनीय पीढ़ीगत चोटियों के साथ प्रयोग किया जाता है. प्रसार विश्लेषण मॉड्यूल (यहाँ ModFit लेफ्टिनेंट 3.3 संस्करण) युक्त प्रोग्राम चलाएँ. सेट (उदाहरण के लिए, एक प्रेरित 96 घंटा संस्कृति PKH26 स्थिति कोशिकाओं की तालिका 1 में 8 के लिए ट्यूब counterstained) विश्लेषण किया जा डेटा से प्रेरित PKH26 स्थिति फ़ाइल लोड. विश्लेषण के लिए पैरामीटर इस मामले PKH26 (42/585) व्यवहार्य पर gated (neg 7-एएडी) CD3 स्थिति लिम्फोसाइटों और FSC बनाम छोटे मलबे और बड़ी समुच्चय (3 चित्रा) को बाहर एसएससी में चयन करें. परिभाषित करने मेंइन क्षेत्रों उच्च आगे क्षेत्र बिखेरा जहां विस्फोटों आम तौर पर पाए जाते हैं शामिल हैं और ध्यान दें कि. CD3 अभिव्यक्ति नीचे संग्राहक प्रेरित संस्कृतियों में हो सकता है सावधान रहना. एक नया प्रसार प्रसार विज़ार्ड का उपयोग मॉडल बनाएँ. ओपन डाटा फ़ाइल (प्रारंभ टैब) का उपयोग करना, unstimulated PKH26 स्थिति नियंत्रण फाइल लोड और माता पिता अविभाजित कोशिकाओं को इसी वितरण में शिखर चैनल के स्थान को परिभाषित. Unstimulated PKH26 स्थिति नियंत्रण के लिए फ़ाइल का विश्लेषण करने के लिए, पैतृक चरम स्थिति और चौड़ाई (मानक विचलन) के लिए मूल्यों टिप्पण. यदि चोटी एक निश्चित चौड़ाई (एसडी) वांछित है, बंद एसडी की जाँच करें. लोड PKH26 neg नियंत्रण (जैसे, एक 96 घंटा संस्कृति PKH26 neg कोशिकाओं की तालिका 1 में 7 ट्यूब के लिए counterstained). PKH26 neg नियंत्रण ऊपर dimmest पीढ़ी के लिए पीक चैनल की स्थापना द्वारा पीढ़ियों की संख्या को समायोजित करें. यह परमाणु निर्धारित करता हैबेटी पीढ़ियों मॉडल सही फिट कर सकते हैं की mber और आम तौर पर 6-9 पीढ़ियों. प्रेरित नमूने के लिए डेटा फ़ाइल (उदाहरण के लिए, एक प्रेरित 96 घंटा PKH26 स्थिति कोशिकाओं की संस्कृति के रूप में 1 तालिका में 8 के लिए ट्यूब counterstained) खोलें और इसकी पुष्टि कि पैतृक चरम स्थिति और एसडी के रूप में 4.7 चरण में परिभाषित के लिए क्षेत्रों अपरिवर्तित ही रहेंगे. यदि तय पीढ़ीगत रिक्ति वांछित है, मानक मॉडल विकल्प का चयन करें, अन्यथा फ्लोटिंग विकल्प का चयन करें. डेटा सेट में एक प्रायोगिक फाइल का विश्लेषण करने के लिए, एक ही 4.9 चरण में परिभाषित मॉडल का उपयोग. माता – पिता की चरम स्थिति को मामूली समायोजन बहुत अच्छी फिट करने के लिए आवश्यक हो सकता है के रूप में दोनों नेत्रहीन और कम ची वर्ग मूल्य (आरसीएस) द्वारा परिभाषित किया जा सकता है. वांछित प्रसार डेटा सेट में प्रत्येक प्रयोगात्मक फ़ाइल के लिए सबसे अच्छा फिट से उत्पन्न मैट्रिक्स रिकार्ड. संभव मैट्रिक्स की एक व्यापक वर्णन के लिए रेफरी देखें. 22.

Representative Results

तरह PKH26 झिल्ली रंजक कोशिका झिल्ली में बजाय रासायनिक प्रतिक्रिया (CFSE के लिए) या संतुलन बाध्यकारी (एंटीबॉडी के लिए) द्वारा पास तात्कालिक विभाजन से दाग. चित्रा 2 में दिखाया प्रकार के मंद या विषम धुंधला हो में महत्वपूर्ण चित्रा 1 में उल्लिखित मुद्दों के लिए ध्यान की कमी हो सकता है. इसके विपरीत, अनुकूलित लेबलिंग शर्तों का उपयोग (1 चित्र, तालिका 2) उज्ज्वल सजातीय कोशिका विभाजन डाई कमजोर पड़ने (3 चित्रा) के आधार पर निगरानी सहित सेल ट्रैकिंग अनुप्रयोगों की एक किस्म के लिए उपयुक्त वितरण में परिणाम है. मृत मरने कोशिकाओं / ट्रैकिंग डाई की मात्रा, जो व्यापक और / या तिरछा बेटी पीढ़ी तीव्रता और प्रसार डाई 3,4,16,18 कमजोर पड़ने पर आधारित मॉडलिंग जटिल बदलती खो देते हैं. एक व्यवहार्यता डाई का प्रयोग इसलिए जब स्थिति है जहां मृत कोशिकाओं की संख्या महत्वपूर्ण पूर्व किया जा सकता है के तहत डाई कमजोर पड़ने डेटा इकट्ठा करने की सिफारिश की हैप्रेरित (3 चित्रा) संस्कृतियों या पुराने नमूनों (चित्रा 4) के रूप में भेजा. डाई लेबलिंग ट्रैकिंग क्योंकि आम तौर पर प्रतिदीप्ति तीव्रता परिमाण immunophenotyping से अधिक के कई आदेश देता है, यह महत्वपूर्ण है के लिए उचित मुआवजा नियंत्रण (1 टेबल) में शामिल हैं और सत्यापित करने के लिए कि डाई ट्रैकिंग की उपस्थिति के लिए सकारात्मक और नकारात्मक एंटीबॉडी कोशिकाओं (चित्रा को हल करने की क्षमता क्षीण नहीं करता ) 4 से बचने अत्यधिक रंग मुआवजे के लिए की जरूरत है., यह बेहतर है ट्रैकिंग डाई करने के लिए एक उज्ज्वल fluorochrome, या जीवित कोशिकाओं द्वारा बाहर रखा डाई के रूप में ब्याज की कोशिकाओं पर नहीं मिला एक, वर्णक्रमीय चैनल में (ओं) आसन्न जगह (चित्रा -4 ए और बी बनाम 4C एवं विकास). जब शिखर मॉडलिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए प्रसार की हद तक यों, एक अच्छा फिट प्राप्त डाई कमजोर पड़ने प्रोफेसर की विशेषताओं के मॉडल के भीतर मिलान मान्यताओं की आवश्यकता हैiles (5 चित्रा और तालिका 3) का विश्लेषण किया जा रहा है. ट्रैकिंग रंजक और व्यवहार्यता अभिकर्मकों का उचित चयन के साथ, यह भी संभव है अनेक लिम्फोसाइट subpopulations में proliferative प्रतिक्रियाओं विशेषताएँ एक साथ. उदाहरण के लिए, के रूप में चित्रा 6 में सचित्र, एक 2 ट्रैकिंग डाई के अलावा विनियामक टी कोशिकाओं (CellVue Claret के साथ लेबल) और उच्च proliferated effector टी कोशिकाओं के बीच भेदभाव को सरल (CFSE के साथ लेबल) और उनकी बातचीत के बारे में बहुत अधिक विस्तार से प्राप्त किया जा सकता है प्रदान करता है 3 एच thymidine 18,27 लेबलिंग का उपयोग. चित्रा 1. , PKH67 PKH26 और CellVue रंजक के लिए जनरल झिल्ली लेबलिंग प्रोटोकॉल सेल MEMBRA में इन अत्यधिक lipophilic रंगों के विभाजनnes अनिवार्य रूप से तुरन्त कोशिकाओं जब धुंधला हो जाना नमक मुक्त तनुकारक (वस्तु) सी डाई विलेयता और धुंधला क्षमता को अधिकतम करने के लिए प्रदान की वाहन में किया जाता है के साथ मिश्रण पर होता है. के रूप में सामान्य झिल्ली लेबलिंग के लिए इस योजना में PKH26 साथ संक्षेप में, उज्ज्वल, वर्दी और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य धुंधला हो इसलिए सबसे आसानी से प्राप्त है: 1) प्रोटीन और / या लवण की मात्रा कम से कम धुंधला हो जाना कदम और 2 में मौजूद) एक मिश्रण तकनीक है कि insures का उपयोग डाई में तेजी से कोशिकाओं की सजातीय प्रसार (यानी, एक साथ डाई उसी की एकाग्रता के लिए सभी कोशिकाओं को उजागर करता है). चित्रा 2. प्रतिदीप्ति PKH26 वितरण (रेफरी से reprinted 18) की स्थिति पर धुंधला का प्रभाव. लघुगणकीय बढ़ रही है, सभ्य यू के नमूने की नकल- परिवेश के तापमान पर 3 मिनट के लिए साथ या बिना 2x कोशिकाओं के अलावा करने के लिए डाई 2x पर तत्काल मिश्रण,: 937 कोशिकाओं PKH26 (15 PKH26 सुक्ष्ममापी 1 10 x 7 कोशिकाओं / एमएल, 12 अंतिम सांद्रता) के साथ दाग थे. धोने के बाद, एक Beckman कल्टर सियान प्रवाह निरंतर साधन सेटिंग्स का उपयोग cytometer पर दाग कोशिकाओं का विश्लेषण किया गया 1 हिस्टोग्राम: PKH26 डिटेक्टर वोल्टेज के साथ अस्थिर नियंत्रण पहले दशक में कुछ / नहीं कोशिकाओं 1 चैनल में जमते के साथ बड़े पैमाने पर सभी कोशिकाओं जगह समायोजित. 2 हिस्टोग्राम: 15 सुक्ष्ममापी डाई में धुंधला हो 2x कोशिकाओं के अलावा का उपयोग करने के लिए तत्काल मिश्रण के साथ डाई 2x कुछ / नहीं पिछले चैनल में जमते कोशिकाओं (gMFI = के साथ एक उज्ज्वल, homogenously दाग, चौथे दशक में रखा कोशिकाओं के सममित आबादी में परिणामस्वरूप 2548, GCV = 26.2%) 3 हिस्टोग्राम: 15 सुक्ष्ममापी 2x कोशिकाओं के अलावा का उपयोग करने के लिए डाई 2x डाई लेकिन बिना तत्काल मिश्रण धुंधला एक कम तीव्रता में हुई और एक व्यापक CV (gMFI 505 = , GCV = 116)% के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक dimly दाग subpopulation, संभवतः ट्यूब की दीवार पर बजाय 2x डाई समाधान में तिरस्कृत कोशिकाओं की एक बूंद के लिए कारण हिस्टोग्राम 4: एक धुंधला त्रुटि 3 केंद्रित ethanolic डाई के μl नेतृत्व स्टॉक सीधे जोड़ा जा रहा है आगे तनुकारक (वस्तु) सी. में एक 2x डाई समाधान इसके परिणामस्वरूप 12 सुक्ष्ममापी की एक अंतिम डाई एकाग्रता में तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है बजाय मिश्रण के बिना तनुकारक (वस्तु) सी में कोशिकाओं 2x लेकिन अत्यंत मंद और विषम (धुंधला हो जाना दिया gMFI = 32.9, GCV = 1020%). मनाया सही तिरछा सबसे अधिक संभावना के संयुक्त प्रभाव को दर्शाता है: i) गरीब व्यापक रूप से भिन्न सेल और डाई संस्करणों के कारण मिश्रण है, और ii) तथ्य यह है कि डाई वितरण बिंदु निकटतम कोशिकाओं डाई की एक उच्च एकाग्रता के लिए उन लोगों की तुलना में किया जाएगा आगे उजागर दूर बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें . फिर से 3 "src =" / files/ftp_upload/4287/4287fig3.jpg "के लिए: सामग्री चौड़ाई =" 4.5in "के लिए" = "/ files/ftp_upload/4287/4287fig3highres.jpg /"> चित्रा 3. एक व्यवहार्यता की जांच की प्रयोग टी सेल प्रसार प्रोफाइल के gating सरल है hPBMC PKH26 (अंतिम सेल एकाग्रता: 3×10 7 मिलीग्राम / अंतिम डाई एकाग्रता: 10 सुक्ष्ममापी) के साथ लेबल रहे थे. उपस्थिति में 96 घंटे (उत्तेजित) या विरोधी CD3 और IL-2 का अभाव (unstimulated) के लिए संस्कृति के बाद, कोशिकाओं विरोधी CD3 – FITC, विरोधी CD19-APC और 7-AAD के साथ counterstained थे, और एक पर विश्लेषण किया गया FACSCalibur प्रवाह cytometer (विवरण के लिए 13 संदर्भ देखें). रंग मुआवजा डाटा अधिग्रहण के समय में hardwired मुआवजा circuitry का उपयोग किया गया था. प्रसार की हद तक के रूप में चरण 4 में वर्णित LT3.3 ModFit में परमाणु अप्रसार विज़ार्ड का उपयोग करने के लिए मॉडलिंग की थी. डेटा PKH26 neg नियंत्रण (1 टेबल, 7 ट्यूब) से संदर्भ (3 कॉलम में ग्रे भरा histograms) के लिए मढ़ा. Unstimulated लिए viabilities और एसटीआईmulated संस्कृतियों 76% और 62% (पैनल के लिए ungated डेटा क्रमश: ए और बी,) पैनल ए PKH26 दाग मध्यम में 96 घंटे के लिए संवर्धित कोशिकाओं थे gated व्यवहार्य (neg 7-एएडी) CD3 स्थिति कोशिकाओं (R1) शामिल थे. एंटीबॉडी शामिल किए जाने और 7 AAD मृत सेल अपवर्जन गेट के अलावा, एक आगे (FSC) तितर बितर बनाम ओर तितर बितर (एसएससी) फाटक (R2) मलबे और समुच्चय को बाहर करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. इस पैनल में पिछले साजिश में मृत कोशिकाओं के अभाव नोट. सबसे अच्छा PKH26 प्रसार प्रोफ़ाइल (3 स्तंभ) के लिए फिट मॉडल आरसीएस = (6 दाता, तालिका 3) 2.1, यह दर्शाता है अच्छा समरूपता के साथ एक एकल शिखर दिया गया था, और माता – पिता की स्थिति को परिभाषित करने के लिए प्रयोग किया जाता और उत्तेजित के विश्लेषण के लिए पीक चौड़ाई शुरू इस डेटा सेट (पैनल बी) से नमूना पैनल बी. PKH26 दाग कोशिकाओं के एक दोहराने अशेष भाजक विरोधी CD3 और IL-2 के साथ 96 घंटे और gated के लिए संवर्धित अस्थायी चरम स्थिति के साथ एक मॉडल के रूप में पैनल में एक ही रास्ते में और अस्थायी शिखर चौड़ाई दिया आरसीएस 1.3 = (6 दाता, 3 तालिका). पैनल कक्ष में एक 7-AAD डेटा के उपयोग के बिना विश्लेषण किया गया था उसी डेटा फ़ाइल सी. के साथ इस डेटा के लिए सबसे अच्छा फिट. जब एक प्राथमिक FSC बनाम एसएससी के लिए आंशिक रूप से मृत कोशिकाओं और समुच्चय (R2) और CD3 सकारात्मक घटनाओं (R3) का चयन करने के लिए एक उच्च माध्यमिक गेट को बाहर करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, मृत कोशिकाओं के एक छोटे से अवशिष्ट जनसंख्या रहे (gated घटनाओं 0.2%). सबसे अच्छा फिट मॉडल = आरसीएस 2.2 पैनल डी. उसी डेटा फ़ाइल के साथ एक एकल शिखर कक्ष में बी gated था पैनल में सी. के रूप में प्रेरित नमूने में बड़ा मृत कोशिकाओं की अवशिष्ट जनसंख्या नोट (gated घटनाओं की 1.29%) दिया इस gating रणनीति के लिए. सबसे अच्छा फिट मॉडल एक अस्थायी चरम स्थिति और अस्थायी चोटी चौड़ाई (= आरसीएस 1.3) के साथ था. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें . ig4.jpg "के लिए: सामग्री चौड़ाई =" 5in "के लिए" = "/ files/ftp_upload/4287/4287fig4highres.jpg /"> चित्रा 4. Fluorochrome चुनाव और करने की क्षमता पर डाई immunophenotype PKH26 साथ लेबल लिम्फोसाइटों के लिए एकाग्रता का प्रभाव. HPBMC 24-घंटा पुराने रक्त से अलग थे और PKH26 के रूप में चरण 1 में वर्णित के साथ अपवाद है कि धुंधला हो जाना 12 x 75 मिमी दौर नीचे में किया गया था के साथ, लेबल polystyrene 12 x 75 मिमी शंक्वाकार polypropylene ट्यूबों बजाय ट्यूब. तत्काल इस PKH26 साथ लेबलिंग के बाद, कोशिकाओं को संकेत immunophenotypic और व्यवहार्यता अभिकर्मकों के साथ counterstained किया गया है, और एक LSRFortessa प्रवाह cytometer चित्रा 3A gating रणनीति और निम्नलिखित ऑप्टिकल विन्यास का उपयोग पर विश्लेषण: 488 एनएम लेजर: FSC-A (488 एनएम), एसएससी (बीपी 488/10), FITC (बीपी 530/30)-A, PKH26 – ए (575/26 बीपी), 7-AAD-A या PerCP-A (बीपी 695/40). 640 एनएम लेजर: APC एक या Topro-3-A (बीपी 670/14). रंग मुआवजा डाटा अधिग्रहण के समय में BD दिवा सॉफ्टवेयर का उपयोग किया गया था. "ऑटो"प्रासंगिक वर्णक्रमीय विंडो में नियंत्रण नहीं एंटीबॉडी autofluorescence (ए और बी, PerCP पैनलों सी और डी के लिए पैनलों के लिए APC) इंगित करता है. PKH26 neg नियंत्रण (1 टेबल, 7 ट्यूब) से डेटा संदर्भ (ग्रे भरा histograms, 5 स्तंभ) के लिए मढ़ा कर रहे हैं. बाद धुंधला viabilities सभी नमूने (88-92%) के लिए इसी तरह के थे पैनल ए 2 सुक्ष्ममापी की एक अंतिम एकाग्रता में PKH26 साथ लेबल की कोशिकाओं विरोधी CD3 FITC, विरोधी CD4-APC, और (7 – AAD का उपयोग कर रहे थे counterstained 3 टेबल के 8 ट्यूब). व्यवहार्य पर gating (7-AAD neg) CD3 स्थिति (1 कॉलम) लिम्फोसाइटों और मलबे और FSC और एसएससी (चित्रा 3A देखें) पर आधारित समुच्चय के बहिष्कार के बाद, PKH26 तीव्रता APC CD4 (2 स्तंभ और 3) के साथ संयोजन में मूल्यांकन किया गया था. चाहे (2 स्तंभ) uncompensated या मुआवजा (3 स्तंभ), इस fluorochrome संयोजन CD4 स्थिति टी कोशिकाओं और CD4 neg टी कोशिकाओं के बीच अच्छा संकल्प में हुई), के रूप में एक नहीं दोनों के द्वारा सत्यापितntibody, autofluorescent नियंत्रण (1 तालिका के 6 ट्यूब, स्तंभ 4) और CD3 बनाम की साजिश दो रंग. (6 कॉलम) CD4 पैनल बी. एक ही fluorochrome संयोजन का उपयोग के रूप में एक पैनल में है, लेकिन 4 सुक्ष्ममापी अंतिम PKH26 एकाग्रता बढ़ती पर प्रतिकूल CD4 neg टी कोशिकाओं CD4 स्थिति टी कोशिकाओं को हल करने की क्षमता को प्रभावित नहीं किया एक पैनल सी.. स्वतंत्र रूप से 2 सुक्ष्ममापी की एक अंतिम एकाग्रता में PKH26 साथ लेबल कोशिकाओं के दोहराने अशेष भाजक विरोधी CD3 FITC, विरोधी CD4 – PerCP, और Topro-3 का उपयोग counterstained किया गया था. व्यवहार्य CD3 (Topro 3 neg) स्थिति (1 कॉलम) लिम्फोसाइटों और मलबे और FSC और एसएससी (चित्रा 3A देखें) पर आधारित समुच्चय के बहिष्कार पर gating बाद, PKH26 तीव्रता विरोधी CD4 PerCP (2 कॉलम और के साथ संयोजन में मूल्यांकन किया गया था ) 3. पर्याप्त PerCP चैनल में वर्णक्रमीय PKH26 ओवरलैप uncompensated डेटा (2 स्तंभ) में स्पष्ट और PKH26 स्थिति CD4 के बीच संकल्प है <sup> स्थिति और PKH26 स्थिति CD4 neg घटनाओं के बाद सीमांत मुआवजा (कोई एंटीबॉडी, autofluorescent स्तंभ 4 में दिखाया नियंत्रण के साथ कॉलम 3 की तुलना) लागू किया जाता है पैनल डी. जब PKH26 एकाग्रता 4 सुक्ष्ममापी की वृद्धि हुई है, यह अब संभव नहीं है पैनल सी. वर्णक्रमीय ओवरलैप PKH26 से PerCP चैनल में fluorochrome संयोजन का उपयोग (2 स्तंभ) CD4 और CD4 से संकेत की तीव्रता से अधिक स्थिति स्थिति PKH26 घटना अब CD4 से neg PKH26 स्थिति टी कोशिकाओं (3 कॉलम हल किया जा सकता है स्तंभ 4) बनाम. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें . चित्रा 5. प्रसार मॉडल चयन पर प्रभाव. डाई कमजोर पड़ने प्रोफाइल के लिए फिट की अच्छाई hPBMC PKH26 थे लेबल के साथ (:, अंतिम डाई एकाग्रता 3×10 7 / मिलीलीटर: 10 सुक्ष्ममापी अंतिम सेल एकाग्रता). उपस्थिति में 96 घंटे (उत्तेजित) या विरोधी CD3 और IL-2 का अभाव (unstimulated) के लिए संस्कृति के बाद, कोशिकाओं को काटा गया विरोधी CD3 FITC, विरोधी CD19-APC और 7-AAD और एक FACSCalibur पर विश्लेषण के साथ counterstained प्रवाह cytometer (विस्तृत तरीकों के लिए 13 संदर्भ देखें). रंग मुआवजा डाटा अधिग्रहण के समय में hardwired मुआवजा circuitry का उपयोग किया था पैनल 5 दाता, एक उदारवादी प्रत्युत्तर, के लिए एक unstimulated 96 घंटा संस्कृति से PKH26 तीव्रता प्रोफाइल. Gated चित्रा 3A में दिखाया और ModFit परमाणु अप्रसार को प्रदान करने के लिए इस्तेमाल किया था शिखर पैनल. बी अविभाजित माता पिता कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करने के लिए स्थिति और चौड़ाई के पहले अनुमान के साथ जादूगर PKH26 एक समानांतर से तीव्रता प्रोफाइल 96 घंटा संस्कृति को प्रेरित किया. से शुरू करने का अनुमान है का उपयोग कर विश्लेषण किया गया थालगातार बेटी पीढ़ियों के लिए 'परमाणु अप्रसार जादूगर' सेटिंग की एक और 4 विभिन्न संयोजनों, निश्चित या अस्थायी पीक तीव्रता से इसी, और स्थायी या अस्थायी चोटी चौड़ाई पैनल के रूप में दिखाया गया है. के रूप में 3 टेबल, मॉडल कि मनाया डेटा के लिए सबसे अच्छा फिट दिया में संक्षेप (न्यूनतम कम ची के वर्ग, आरसीएस) "अस्थायी / अस्थायी" संयोजन में जो न केवल शिखर लेकिन यह भी पदों बेटी पीढ़ी चोटियों के मानक विचलन की अनुमति दी गई थी के लिए अलग अलग (= आरसीएस 1.5). एक ही मॉडल दाता 6, एक उच्च प्रत्युत्तर (चित्रा 3B और तालिका 3) के लिए सबसे अच्छा फिट दिया. 6 चित्रा. एक दूसरे सेल ट्रैकिंग डाई के अलावा एक प्रवाह cytometric दमन परख में effector और विनियामक टी कोशिकाओं के बीच भेदभाव को सरल(रेफरी से अनुकूलित 18) Monocyte समाप्त TRIMA leukapheresis फिल्टर से तैयार लिम्फोसाइटों विरोधी CD127 पीई, विरोधी CD4 पीई Cy7 साथ दाग रहे थे, और विरोधी CD25 APC और प्रवाह effector (Teff की आबादी में हल. CD4 स्थिति CD127 मंद CD25 स्थिति), और सहायक कोशिकाओं (CD4 neg), स्थिति CD127 उज्ज्वल CD25) मंद, नियामक (Treg CD4. और हल Teff CFSE (सेल अंतिम एकाग्रता: 5 × 10 7 मिलीग्राम /, अंतिम डाई एकाग्रता, 5 सुक्ष्ममापी) के साथ लेबल:;: के आधार पर छाँटे गए Treg CellVue (फाइनल डाई एकाग्रता 1×10 6 मिलीग्राम / 1 सुक्ष्ममापी अंतिम सेल एकाग्रता) क्लैरट साथ लेबल कोशिकाओं रहे थे विरोधी CD3, विरोधी CD28 और विकिरणित सहायक कोशिकाओं की उपस्थिति में अलग अनुपात में सह सुसंस्कृत. 96 घंटा बाद संस्कृतियों काटा गया, विरोधी CD4 पीई Cy7 और रहते हैं / DEAD fixable वायलेट के साथ counterstained, और एक LSRII प्रवाह cytometer और रंग मुआवजा पर विश्लेषण डेटा acquisitio के समय में प्रदर्शन किया गया थाn BD दिवा सॉफ्टवेयर (18 मुआवजा नियंत्रण सहित जानकारी के लिए संदर्भ देखें) का उपयोग कर. Teff और Treg के लिए प्रसार सूचकांक चरण 4 में वर्णित के रूप में modeled थे, LT3.3 ModFit में प्रसार विज़ार्ड का उपयोग. पैनलों बी और सी में डेटा पॉइंट्स मतलब ± 1 तीनप्रतियाँ नमूनों की मानक विचलन का प्रतिनिधित्व पैनल ए प्रतिनिधि डेटा एक तीन तीन प्रतियों के नमूने के लिए एक Treg पर दिखाए जाते हैं: 0.25:1 के अनुपात Teff. अन्य सभी डेटा भूखंडों से, लाइव / मृत fixable वायलेट अभिकर्मक मृत कोशिकाओं (= लाल – भूरे रंग के, nonviable Teff = ग्रे और nonviable Treg = लाल सहायक कोशिकाओं R1, ऊपरी बाएँ साजिश) को बाहर निकालने के लिए इस्तेमाल किया गया था. CellVue क्लैरट धुंधला व्यवहार्य Treg (R4, केंद्र सही भूखंड, नीला) भेद व्यवहार्य से इस्तेमाल किया गया था, लेकिन अत्यधिक Teff (R5, केंद्र सही साजिश, हरी) proliferated. Gating द्वारा एक एकल Teff (निचले बाएँ साजिश) के लिए पैरामीटर CFSE प्रसार प्रोफाइल कोशिकाओं है कि (R5) CFSE स्थिति, CD4 (R3) स्थिति, व्यवहार्य नहीं है (R1) थे पर उत्पन्न किया गया था, और लिम्फोसाइट सुप्रीम कोर्ट नेatter गुण (R2). Treg के लिए एक एकल पैरामीटर CellVue क्लैरट प्रसार प्रोफाइल कोशिकाओं है कि CellVue क्लैरट (R4) स्थिति, CD4 (R3) स्थिति, व्यवहार्य नहीं है (R1) थे पर gating द्वारा उत्पन्न किया गया था, और लिम्फोसाइट तितर बितर गुण (R2) था. उदार लिम्फोसाइट (R2) क्षेत्र लिम्फोसाइट विस्फोटों में शामिल करने के लिए परिभाषित नोट. नोट भी है कि एकत्र किया जा कोशिकाओं की कुल संख्या कम से कम ब्याज की आवृत्ति आबादी पर निर्भर करता है. एक सेल प्रसार प्रयोग में जहां ब्याज की आबादी सात या आठ पीढ़ियों के लिए कक्षों की एक बड़ी संख्या का प्रतिनिधित्व तीव्रता के एक विस्तृत रेंज पर वितरित किया जा सकता है क्रम में करने के लिए सही मॉडल और हर पीढ़ी में कोशिकाओं की संख्या की गणना करने के लिए एकत्र किया जाना चाहिए. जब दुर्लभ कोशिकाओं का अध्ययन, यह आवश्यक हो बस नमूना लगभग सूखी ट्यूब चलाने के क्रम में घटनाओं की अधिकतम संभव संख्या में एकत्र हो सकता है. नमूना यहाँ दिखाया गया है, ऐसा ~ 25,000 घटनाओं, (परमाणु अप्रसार मैं जिनमें से 11,923 Teff थे की एक कुल में हुईndex 3.85) और 1380 Treg (प्रसार इंडेक्स 1.83) थे पैनल बी जैसी कि उम्मीद थी, Teff सेल प्रसार का अधिक से अधिक दमन करने के लिए नेतृत्व सह संस्कृतियों में Tregs वर्तमान के अनुपात में वृद्धि. क्लैरट दाग दोनों CellVue (ठोस लाइन) या अस्थिर Treg (डैश्ड रेखा) के साथ इसी तरह के परिणाम प्राप्त किया गया, डाई CellVue क्लैरट ट्रैकिंग के साथ कि धुंधला का संकेत किया था प्रभावित शक्ति Treg पैनल सी. Treg. अपेक्षाकृत अनूर्ज हैं, के रूप में की उम्मीद किया था, पैदा करना नहीं है जब विरोधी CD3 विरोधी CD28, और Teff कोशिकाओं (Treg: Teff 01:00 का अनुपात) के अभाव में गौण कोशिकाओं के साथ incubated. हालांकि, के रूप में सह संस्कृतियों में Teff वर्तमान के अनुपात में वृद्धि हुई है (यानी, Treg के रूप में: Teff अनुपात में कमी), Treg प्रसार की हद तक भी वृद्धि हुई है. आम तौर पर बड़े हिस्से में कम से कम इन आंकड़ों के लिए त्रुटि सलाखों के प्रसार के हद तक सीमित प्रतिबिंबित करती हैं, एकत्र Teff के सापेक्ष और अधिक से अधिक अनिश्चित घटनाओं की छोटी संख्या के लिए अग्रणीहर पीढ़ी में कोशिकाओं की संख्या मॉडलिंग में ty. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें . ट्यूब संख्या (उद्देश्य) PKH26 एंटीबॉडी (ies) 7-AAD 1 (सेटअप मुआवजा) – – – 2 (सेटअप मुआवजा) + – – 3 (सेटअप मुआवजा) – – + 4 (मुआवजा) – CD8 – FITC ख – 5 (मुआवजा) – CD8 – APC ख – 6 (कोई अब नियंत्रण) + – + 7 (कोई ट्रैकिंग डाई चोरtrol) – CD3 FITC CD4 APC या CD19-APC ग + 8 (T0 नियंत्रण) + CD3 FITC CD4 APC या CD19-APC ग + 1 टेबल साधन सेटअप नियंत्रणों सूचीबद्ध नियंत्रण 4 रंग सीडी 4 टी सेल प्रसार निगरानी का उपयोग परख के लिए उपयुक्त हैं: PKH26 (प्रसार डाई), CD3 FITC (अखिल टी सेल मार्कर) CD4 APC (टी सहायक है. मार्कर सेल), 7 aminoactinomycin डी बी (7 AAD, मृत सेल अपवर्जन) CD3 – FITC और CD4 APC के लिए उज्जवल surrogates (बेहतर मुआवजा त्रुटियों का पता लगाने की क्षमता) ग चित्रा 3: CD3 FITC और CD19-APC. घ चित्रा 4: CD3 – FITC और CD4 APC. सेल प्रकार Final सेल एकाग्रता अंतिम डाई एकाग्रता </Strong> संदर्भ hPBMC ख 1 10 x 7 मिलीग्राम / 2 PKH67 सुक्ष्ममापी 10,17 5 x 6 मिलीग्राम / 10 2 PKH26 सुक्ष्ममापी 12 3 10 x 7 मिलीग्राम / 10 PKH26 सुक्ष्ममापी 13 5 10 x 7 मिलीग्राम / 30 PKH26 सुक्ष्ममापी 18 1 10 x 6 मिलीग्राम / 1 सुक्ष्ममापी CellVue क्लैरट ग 18 3 10 x 7 मिलीग्राम / 4 सुक्ष्ममापी CellVue क्लैरट 13 5 10 x 7 मिलीग्राम / 5 सुक्ष्ममापी CellVue क्लैरट 18 संस्कृति में कोशिकाओं 5 x 10 5 मिलीग्राम / 0.1 PKH26 सुक्ष्ममापी (1 ° स्तन कोशिकाओं) 8 1 10 x 7 मिलीग्राम / 15 PKH26 सुक्ष्ममापी (U937) 18 1 10 x 7 मिलीग्राम / 12.5 -15 PKH26 सुक्ष्ममापी (U937) 15 1 10 x 7 मिलीग्राम / 1 सुक्ष्ममापी PKH67 (K562) 18 1 10 x 7 मिलीग्राम / 1 PKH67 सुक्ष्ममापी (टी सेल लाइनों) 9 1 10 x 7 मिलीग्राम / 10 सुक्ष्ममापी CellVue क्लैरट (YAC 1) 23 तालिका 2 गैर perturbing. झिल्ली डाई धुंधला स्थितियां एक अनुकूलित और रेफरी से अद्यतन. 18 ख एक कम गति धोने (300 XG) प्लेटलेट संदूषण को कम करने के लिए इस्तेमाल किया गया था ग Treg कोशिकाओं (प्रवाह क्रमबद्ध CD4 स्थिति CD25 स्थिति CD127 neg लिम्फोसाइटों). मॉडल सेटिंग्स <td colsपैन> = "6" मॉडल परिणाम दाता उपचार चरम स्थिति एसडी माता पिता की स्थिति माता पिता एसडी # Peaks के फ़िट की आरसीएस पीआई पीएफ 5 Unstimulated नाव नाव 209 4.5 1 5.1 1.0 0 5 संदीप्त फिक्स्ड फिक्स्ड 209 <> td 4.5 7 35 3.9 31 5 संदीप्त नाव फिक्स्ड 209 4.5 8 19 4.3 30 5 संदीप्त फिक्स्ड नाव 209 9.2 6 1.9 3.8 30 5 संदीप्त नाव नाव 209 9.0 7 1.5 3.7 29 6 Unstimulated नाव नाव 205 4.0 1 2.1 1.0 0 6 संदीप्त फिक्स्ड फिक्स्ड 205 4.0 6 42 6.6 60 6 </P> संदीप्त नाव फिक्स्ड 205 4.0 7 12 7.4 60 6 संदीप्त फिक्स्ड नाव 205 8.6 6 6.9 6.8 62 6 संदीप्त नाव नाव 205 6.5 6 1.3 6.5 59 तालिका 3 अप्रसार मॉडल की फ़िट की विशेषता (आरसीएस) और परमाणु अप्रसार एक नमूना धुंधला हो जाना, डेटा संग्रह और gating चित्रा 3 ए और बी में वर्णित के रूप में मेट्रिक्स पर प्रभाव.

Discussion

यहाँ वर्णित तरीकों हमारे संयुक्त प्रयोगशालाओं में पाया गया सबसे hPBMC ^13,16,18 झिल्ली रंगों का उपयोग कर लेबलिंग के लिए और लिम्फोसाइट सबसेट phenotyping और प्रसार ट्रैकिंग या झिल्ली या प्रोटीन ^2,11,13,16 रंगों का उपयोग करने के लिए मज़बूती से इष्टतम परिणाम दे रहे ^{हैं, 18.} आंकड़े 1 और 2 में सचित्र, उज्ज्वल वर्दी लेबलिंग सबसे आसानी से लवण की शारीरिक उपस्थिति सीमित है और एक मिश्रण तकनीक का उपयोग कर से प्राप्त है कि तेजी से, सभी कोशिकाओं के सजातीय डाई उसी की एकाग्रता के लिए जोखिम में परिणाम. क्योंकि झिल्ली रंगों के साथ धुंधला लिपिड bilayer में विभाजन होता है, तो अन्य चर है कि मुक्त डाई एकाग्रता में परिवर्तन भी लेबलिंग दक्षता को प्रभावित कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, लवण की कम कुशल वार्शआउट में तनुकारक (वस्तु) सी में resuspension पहले दौर नीचे polystyrene ट्यूबों परिणामों में लेबलिंग और भी कम मुक्त डाई ट्यूब दीवारों पर सोखना डाई करने के लिए, विशेष रूप से की वजह से एकाग्रता मेंकम डाई सांद्रता में. दोनों कारकों के लिए व्यापक जब लेबलिंग किया जाता है से धुंधला हो जाना वितरण शंक्वाकार नीचे polypropylene ट्यूब (3 आंकड़े, 4 और का उपयोग कर दे देते हैं अप्रकाशित परिणाम). नमूना उम्र और प्रकार भी शिखर चौड़ाई को प्रभावित कर सकते हैं जब भी अनुकूलित धुंधला हो जाना प्रक्रियाओं का इस्तेमाल किया जाता है. उदाहरण के लिए, हौसले से तैयार की 14-20% से रक्त जबकि 24 घंटे पुराने रक्त नमूनों या TRIMA pheresis फिल्टर रेंज से अलग लिम्फोसाइटों के लिए सीवी (3 चित्रा, रेफरी 13. और अप्रकाशित परिणाम) सीमा से अलग PKH26 ^{स्थिति} लिम्फोसाइटों के लिए सीवी 25-30 से % (4 चित्रा और रेफरी 18.).

एकरूपता और हद तक जो अलाभकारी कोशिकाओं विश्लेषण से बाहर रखा जा सकता है दोनों को प्रभावित कि वर्गो में विभाजनीय बेटी चोटियों डाई कमजोर पड़ने प्रोफाइल, जो बारी में एक प्रसार मॉडल की पसंद को प्रभावित करने के लिए मनाया डेटा (5 और 6 आंकड़े फिट में स्पष्ट कर रहे हैं धुंधला </strong>). हालांकि ModFit (सत्य सॉफ्टवेयर हाउस, Topsham, इ) यहाँ प्रसार सूचकांक और अग्रदूत आवृत्ति (आंकड़े 3, 5 और 6, 3 टेबल) जैसी मीट्रिक उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया सॉफ्टवेयर के एक उदाहरण के रूप में प्रयोग किया जाता है, अन्य सॉफ्टवेयर संकुल भी मॉड्यूल का विश्लेषण करने के लिए होते हैं प्रसार डेटा. ये शामिल FCSExpress (डी नोवो सॉफ्टवेयर, लॉस एंजिल्स, CA) और FlowJo (ट्री स्टार, इंक, Ashland, या). इन कार्यक्रमों के सभी एक गैर रेखीय कम से कम वर्ग विश्लेषण का उपयोग करने iteratively स्थिति, ऊंचाई और गाऊसी अनुक्रमिक बेटी पीढ़ियों का प्रतिनिधित्व चोटियों की एसडी (या चौड़ाई) को बदलने से कच्चे डेटा के लिए सबसे अच्छा फिट खोजने. Proliferative (पीआई) सूचकांक और अग्रदूत आवृत्ति (पीएफ) के प्रसार की हद तक का सबसे अधिक इस्तेमाल किया उपाय कर रहे हैं. PI, रूप में ModFit द्वारा परिभाषित किया गया है, परख के दौरान सेल की संख्या में वृद्धि, एक thymidine तेज परख 'उत्तेजना सूचकांक' अनुरूप का एक उपाय है. पीएफ रिटर्न प्रारंभिक populat में कोशिकाओं के अंशआयन है कि proliferating द्वारा प्रोत्साहन के लिए प्रतिक्रिया व्यक्त की. सावधानी की सलाह दी है, लेकिन, जब साहित्य पढ़ने के बाद से शब्दावली कुछ सॉफ्टवेयर (जैसे, FlowJo और ModFit द्वारा "प्रसार सूचकांक" क्या मतलब है के लिए अलग परिभाषाओं और गणना का उपयोग) संकुल के बीच ^{22 से} भिन्न होता है.

झिल्ली रंगों के साथ प्रसार विश्लेषण और लेबलिंग के लिए महत्वपूर्ण मुद्दों पर चर्चा भी जब प्रोटीन रंगों का उपयोग कर सामना कर रहे हैं. उदाहरण के लिए, मिश्रण तकनीक के लिए सावधान ध्यान भी मृत / मर कोशिकाओं का बहिष्कार के साथ मनाया जाना चाहिए, क्रम में वर्दी वितरण और वर्गो में विभाजनीय बेटी चोटियों को प्राप्त करने के लिए जब (6 चित्रा) CFSE ^2-4,13,18,24 का उपयोग कर. Phenotyping और व्यवहार्यता के मूल्यांकन के लिए fluorochromes का उपयुक्त विकल्प भी महत्वपूर्ण है अत्यधिक वर्णक्रमीय ओवरलैप और एंटीबॉडी पॉजिटिव कोशिकाओं की पहचान करने में असमर्थता से बचने दिखाई उत्सर्जन प्रोटीन ऐसे ^{2-4,11,13,16,18} CFSE के रूप में रंगों के साथ विशेष रूप से, </sup>. ट्रैकिंग डाई की एकाग्रता को कम आसन्न वर्णक्रमीय चैनलों में मुआवजे की समस्याओं को कम हो जाती है, लेकिन यह भी नजर रखी जा सकता है कि सेल डिवीजनों की संख्या की सीमा से पहले बेटी सेल तीव्रता autofluorescence साथ ओवरलैप शुरू. वैकल्पिक रूप से उपयोग करते हैं, दूर लाल उत्सर्जन CellVue (सिग्मा Aldrich, सेंट लुइस, MO) क्लैरट या बैंगनी उत्सर्जक CellTrace वायलेट (जीवन टेक्नोलॉजीज, ग्रांड द्वीप, NY) के रूप में इस तरह के नए सेल ट्रैकिंग रंगों के मुआवजे की समस्याओं को कम कर सकते हैं (चित्रा 6). अंत में, हालांकि झिल्ली रंजक आम तौर पर कम ^11,26 विषाक्तता का प्रदर्शन करते हैं, यह डाई के दोनों वर्ग के साथ लेबल की कोशिकाओं के लिए संभव है. इसलिए यह हमेशा सत्यापित करने के लिए आवश्यक है कि ट्रैकिंग डाई का इस्तेमाल किया एकाग्रता कोशिकाओं की कार्यक्षमता का पता लगाया जा (6 चित्रा) ^3,13,16,18 नहीं बदल दिया गया है.

Materials

Reagent or equipment	Company	Catalogue number	Comments
			Commercially Purchased
7-Aminoactinomycin D	Sigma-Aldrich	A9400
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A4503
Fetal bovine serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150
Hanks balanced salt solution (HBSS)	Life Technologies	14175-079	Calcium and magnesium free, without phenol red
Human IgG Cohn fraction II and III globulins	Sigma-Aldrich	G-4386
Mouse anti-human CD3-FITC	BD Biosciences	349201	Saturating concentration as determined by laboratory titration
Mouse anti-human CD4-APC	BD Biosciences	340672	Saturating concentration as determined by laboratory titration
Mouse anti-human CD4-PECy7	BD Biosciences	348799	Saturating concentration as determined by laboratory titration
Mouse anti-human CD8-FITC	BD Biosciences	347313	Saturating concentration as determined by laboratory titration
Mouse anti-human CD8-APC	Caltag (Life Technologies)	MHCD0805	Saturating concentration as determined by laboratory titration
Mouse anti-human CD19-APC	Caltag (Life Technologies)	MHCD1905	Saturating concentration as determined by laboratory titration
Mouse anti-human CD25-APC	BD Biosciences	340938	Saturating concentration as determined by laboratory titration
Mouse anti-human CD127-PE	BD Biosciences	557938	Saturating concentration as determined by laboratory titration
Mouse anti-human CD3	eBiosciences	16-0037-85	1.0 mg/ml; azide free
Mouse anti-human CD28	eBiosciences	16-0289-85	1.0 mg/ml; azide free
PBS	Gibco	21300-058
PKH26 red fluorescent cell linker kit containing 10-3M PKH26 in EtOH and Diluent C	Sigma-Aldrich	PKH26GL-1KT or MINI26-1KT	Procedures in Step 1 also apply to kits containing PKH67 or other CellVue dyes
CellVue Claret far red fluorescent cell linker kit containing 10-3M CellVue Claret in EtOH and Diluent C	Sigma-Aldrich	MINCLARET-1KT or MIDCLARET-1KT
5-(and-6)-carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester (CFDA-SE)	Invitrogen (Life Technologies)	C34554	Non-fluorescent; cleaved by membrane esterases to form fluorescent amino-reactive carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)
LIVE/DEAD Fixable Violet	Invitrogen (Life Technologies)	L34955
Sterile 12 x 75 mm conical polypropylene tubes & caps	VWR	60818-102	Gives better membrane dye staining efficiency (reduced dye adsorption; less cell loss during supernatant aspiration)
12 x 75 mm round bottom polystyrene tubes	Becton Dickinson	21008-936
Flow cytometer	BD Bioscience	FACSCalibur LSRFortessa	Any cytometer able to detect FITC, PKH26, and 7-AAD (ex. 488 nm; em. 520 nm, 567 nm, and 655 nm, respectively) and APC ex. 633-640 nm; em. 660 nm)
Flow cytometer	Beckman Coulter	LSRII CyAn	Any cytometer able to detect FITC, PKH26, and 7-AAD (ex. 488 nm; em. 520 nm, 567 nm, and 655 nm, respectively) and APC ex. 633-640 nm; em. 660 nm)
			Laboratory Prepared
7-Aminoactinomycin D, concentrated stock	NA	NA	1 mg/ml in PBS. Freeze in aliquots and store at -20 °C.
7-Aminoactinomycin D, working stock	NA	NA	100 μg/ml in PBS; prepare daily from 1 mg/ml frozen stock.
IgG block	NA	NA	HBSS + 10 mg/ml Human IgG Cohn fraction II and III globulins + 10 mg/ml BSA.