Vellykket bruk av celle sporing fargestoffer for å overvåke immun celle funksjon og spredning involverer flere kritiske trinn. Vi beskriver metoder for: 1) å skaffe lys, jevn, reproduserbar etikett-ing med membran fargestoffer, 2) å velge fluorokromer og datainnhenting betingelser, og 3) velger modell å kvantifisere celleproliferasjon basert på fargestoff fortynning.
Fluorescerende celle sporing fargestoffer i kombinasjon med flyt og bilde cytometri, er kraftige verktøy som brukes til å studere samspillet og skjebnene til forskjellige celletyper in vitro og de vivo. 1-5 Selv om det finnes tusenvis av publikasjoner som bruker slike fargestoffer, noen av de mest vanlig forekommende celle sporing søknader omfatte overvåking av:
Kommersielt tilgjengelige celle sporing fargestoffer varierer mye i sine kjemi og fluorescens egenskaper, men det store flertallet faller inn under en av to klasser basert på deres mekanisme celle merking. "Membran fargestoffer", preget av PKH26, er svært lipofile fargestoffer that partisjon stabilt, men ikke-kovalent til cellemembraner 1,2,11. "Protein fargestoffer", preget av CFSE, er amino-reaktive fargestoffer som danner stabile kovalente bindinger med celle proteiner 4,16,18. Hver klasse har sine egne fordeler og begrensninger. Nøkkelen til deres suksess bruk, særlig i flerfarget studier der flere fargestoffer brukes til å spore ulike celletyper, er derfor å forstå de kritiske spørsmålene som muliggjør optimal bruk av hver klasse 2-4,16,18,24.
Protokollene inkludert her trekke fram tre vanlige årsaker til dårlig eller variabel resultater ved bruk av celle-sporing fargestoffer. Disse er:
Eksemplene gitt her illustrerer hvordan disse variablene kan påvirke resultatene ved bruk membran og / eller protein fargestoffer å overvåke celleproliferasjon.
Metodene beskrevet her er de som finnes i våre kombinerte laboratorier til mest pålitelig gi optimale resultater for hPBMC merking med membran fargestoffer 13,16,18 og for lymfocytt subset fenotyping og spredning sporing ved hjelp av enten membran eller protein fargestoffer 2,11,13,16, 18 år. Som illustrert i figur 1 og 2, er lyse ensartet merking lettest oppnås ved å begrense tilstedeværelsen av fysiologiske salter og ved hjelp av en blanding teknikk som fører til hurtig, homogen eksponering av alle celler til samme konsentrasjon av fargestoff. Fordi farging med membran fargestoffer skjer ved partisjonering i lipid bilayer, kan andre variabler som endrer gratis dye konsentrasjon også påvirke merking effektivitet. For eksempel, merking i rundbunnet polystyren rør resulterer i mindre effektiv utvasking av salter før resuspensjon i Diluent C og også i redusert fri fargestoff konsentrasjon på grunn til fargebad adsorpsjon på rørvegger, særligved lavere fargestoff konsentrasjoner. Begge faktorer har en tendens til å gi flekker bredere fordelinger enn når merking er gjort ved hjelp av konisk bunn polypropylenrør (figurene 3, 4 og upubliserte resultater). Sample alder og type kan også påvirke toppbredden selv når optimaliserte flekker prosedyrer brukes. For eksempel CV for PKH26 pos lymfocytter isolert fra ferske trukket blod varierer fra 14-20% (figur 3, Ref. 13 og upubliserte resultater), mens CV for lymfocytter isolert fra 24 timers gamle blodprøver eller TRIMA pheresis filtre utvalg 25-30 % (figur 4 og Ref. 18).
Flekker ensartethet og i hvilken grad ikke-levedyktige celler kan utelukkes fra analyse både påvirke om skjelnes datter toppene er tydelig i fargestoff fortynning profilen, som i sin tur påvirker valg av en spredning modell å passe de observerte data (figur 5 og 6 </strong>). Selv ModFit (Verity Software House, Topsham, ME) brukes her som et eksempel på programvare som brukes til å generere beregninger som Proliferation Index og Precursor Frequency (figur 3, 5 og 6, Tabell 3), andre programvarepakker også inneholde moduler for å analysere spredning data. Disse inkluderer FCSExpress (De Novo Software, Los Angeles, CA) og FlowJo (Tre Star, Inc., Ashland, OR). Alle disse programmene bruker en ikke-lineær minste kvadraters analyse for å iterativt finne den best passer til rådata ved å endre posisjon, høyde og SD (eller bredde) Gaussian topper representerer sekvensielle datter generasjoner. Proliferativ Indeks (PI) og Precursor Frekvens (PF) er de mest brukte tiltak av omfanget av spredning. PI, som definert av ModFit, er et mål på økningen i celletall løpet av analysen, analogt med det 'stimulering indeks' av en tymidin opptak assay. PF returnerer brøkdel av celler i den innledende population som svarte på stimulans ved proliferating. Forsiktighet anbefales, men når du leser litteratur siden terminologi varierer noe mellom programvarepakker (f.eks FlowJo og ModFit bruker forskjellige definisjoner og beregninger for hva som menes med "Proliferation Index") 22.
De kritiske spørsmålene diskutert her for merking og spredning analyse med membran fargestoffer er også oppstått ved bruk protein fargestoffer. For eksempel, må spesiell oppmerksomhet for blandeteknikk også observeres, sammen med uttrekk av døde / døende celler, for å oppnå ensartede distribusjoner og skjelnes datter topper ved bruk CFSE (figur 6) 2-4,13,18,24. Riktig valg av fluorokromer for fenotyping og levedyktighet vurdering er også viktig å unngå overdreven spektral overlapping og manglende evne til å gjenkjenne antistoff positive celler, særlig med synlige utslipp protein fargestoffer som CFSE 2-4,11,13,16,18 </sup>. Redusere konsentrasjonen av sporing fargestoff senker kompensasjon problemer i tilstøtende spektrale kanaler, men også begrenser antall celledelinger som kan overvåkes før dattercelle intensiteter begynner å overlappe med autofluorescens. Alternativt, bruk av nyere celle sporing fargestoffer som langt røde emitting CellVue Claret (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) eller fiolett emitting CellTrace Violet (Life Technologies, Grand Island, NY), kan redusere kompensasjon problemer (figur 6). Til slutt, selv membran fargestoffer generelt en tendens til å utvise mindre toksisitet 11,26, er det mulig å over-label celler med enten klasse av fargestoff. Det er derfor alltid nødvendig å verifisere at konsentrasjonen av sporing fargestoff som brukes ikke har endret funksjonaliteten av cellene som skal spores (figur 6) 3,13,16,18.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker spesielt å takke følgende personer for deres tekniske og intellektuelle bidrag til utviklingen av disse metodene gjennom årene: Bruce Bagwell (Verity Software House), Nadège Bercovici (IDM), Lizanne Breslin (Zynaxis Cell Science and PTI Research) , Brian Gray (PTI Research), Jan Fisher (Dartmouth Medical School), Alice givan (Dartmouth Medical School), Betsy Ohlsson-Wilhelm (SciGro, Inc.), og Mary Waugh (Dartmouth Medical School). De vil også gjerne takke Bowdoin klassen av 2006 fra den årlige kurs i forskningsmetode og anvendelser av flowcytometri, som genererte data vist i figur 2.
Flowcytometri ble utført ved Roswell Park Cancer Institute flowcytometri Laboratory, som ble etablert i en del av utstyr tilskudd fra NIH Delt Instrument Program, og får støtte fra Core Grant (5 P30 CA016056-29) fra NationalCancer Institute til Roswell Park Cancer Institute, og på Abramson Cancer Center flowcytometri og Cell Sortering Resource Laboratory ved University of Pennsylvania, som ble etablert i en del av utstyr tilskudd fra NIH Delt Instrument Program, og får støtte fra NIH # 2P30 CA016520 fra National Cancer Institute. Arbeidet er vist i figur 3 og 5 ble også støttet delvis av SBIR stipend EB00228 fra National Institutes of Biomedical Imaging og bioteknologi (NIBIB) tildelt PTI Research, Inc.
Reagent or equipment | Company | Catalogue number | Comments |
Commercially Purchased | |||
7-Aminoactinomycin D | Sigma-Aldrich | A9400 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
Hanks balanced salt solution (HBSS) | Life Technologies | 14175-079 | Calcium and magnesium free, without phenol red |
Human IgG Cohn fraction II and III globulins | Sigma-Aldrich | G-4386 | |
Mouse anti-human CD3-FITC | BD Biosciences | 349201 | Saturating concentration as determined by laboratory titration |
Mouse anti-human CD4-APC | BD Biosciences | 340672 | Saturating concentration as determined by laboratory titration |
Mouse anti-human CD4-PECy7 | BD Biosciences | 348799 | Saturating concentration as determined by laboratory titration |
Mouse anti-human CD8-FITC | BD Biosciences | 347313 | Saturating concentration as determined by laboratory titration |
Mouse anti-human CD8-APC | Caltag (Life Technologies) | MHCD0805 | Saturating concentration as determined by laboratory titration |
Mouse anti-human CD19-APC | Caltag (Life Technologies) | MHCD1905 | Saturating concentration as determined by laboratory titration |
Mouse anti-human CD25-APC | BD Biosciences | 340938 | Saturating concentration as determined by laboratory titration |
Mouse anti-human CD127-PE | BD Biosciences | 557938 | Saturating concentration as determined by laboratory titration |
Mouse anti-human CD3 | eBiosciences | 16-0037-85 | 1.0 mg/ml; azide free |
Mouse anti-human CD28 | eBiosciences | 16-0289-85 | 1.0 mg/ml; azide free |
PBS | Gibco | 21300-058 | |
PKH26 red fluorescent cell linker kit containing 10-3M PKH26 in EtOH and Diluent C | Sigma-Aldrich | PKH26GL-1KT or MINI26-1KT |
Procedures in Step 1 also apply to kits containing PKH67 or other CellVue dyes |
CellVue Claret far red fluorescent cell linker kit containing 10-3M CellVue Claret in EtOH and Diluent C | Sigma-Aldrich | MINCLARET-1KT or MIDCLARET-1KT | |
5-(and-6)-carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester (CFDA-SE) | Invitrogen (Life Technologies) | C34554 | Non-fluorescent; cleaved by membrane esterases to form fluorescent amino-reactive carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) |
LIVE/DEAD Fixable Violet | Invitrogen (Life Technologies) | L34955 | |
Sterile 12 x 75 mm conical polypropylene tubes & caps |
VWR | 60818-102 | Gives better membrane dye staining efficiency (reduced dye adsorption; less cell loss during supernatant aspiration) |
12 x 75 mm round bottom polystyrene tubes |
Becton Dickinson | 21008-936 | |
Flow cytometer | BD Bioscience | FACSCalibur LSRFortessa |
Any cytometer able to detect FITC, PKH26, and 7-AAD (ex. 488 nm; em. 520 nm, 567 nm, and 655 nm, respectively) and APC ex. 633-640 nm; em. 660 nm) |
Flow cytometer | Beckman Coulter | LSRII CyAn | Any cytometer able to detect FITC, PKH26, and 7-AAD (ex. 488 nm; em. 520 nm, 567 nm, and 655 nm, respectively) and APC ex. 633-640 nm; em. 660 nm) |
Laboratory Prepared | |||
7-Aminoactinomycin D, concentrated stock |
NA | NA | 1 mg/ml in PBS. Freeze in aliquots and store at -20 °C. |
7-Aminoactinomycin D, working stock |
NA | NA | 100 μg/ml in PBS; prepare daily from 1 mg/ml frozen stock. |
IgG block | NA | NA | HBSS + 10 mg/ml Human IgG Cohn fraction II and III globulins + 10 mg/ml BSA. |