Fremskritt innen massespektrometri har tillatt høy gjennomstrømning analyse av protein uttrykk og modifikasjon på en rekke vev. Kombinert med subcellulære fraksjonering og sykdom modeller, kvantitative massespektrometri og bioinformatikk kan avsløre nye egenskaper i biologiske systemer. Metoden er beskrevet her analyserer kromatin-assosierte proteiner i innstillingen av hjertesykdom og er lett anvendelig til andre<em> In vivo</em> Modeller av sykdom hos mennesker.
I kjernen bor de proteomes hvis funksjoner er mest nært knyttet genregulering. Voksen pattedyr cardiomyocyte kjerner er unik på grunn av den høye prosentandel av binucleated celler, 1 har den overveiende heterochromatic tilstanden av DNA, og den ikke-delende natur cardiomyocyte som gjengir voksen atomkjerner i en permanent tilstand av interfase. 2 transkripsjonsregulering under utvikling og sykdom har blitt godt undersøkt i dette organet, 3-5, men det er fortsatt relativt uutforsket er den rollen de kjernefysiske proteiner ansvarlig for DNA emballasje og uttrykk, og hvordan disse proteinene styrer endringene i transcriptional programmer som oppstår under sykdom. 6 I den utviklede verden, er hjertesykdom nummer én årsak til dødelighet for både menn og kvinner. 7 innsikt i hvordan kjernefysiske proteiner samarbeide for å regulere utviklingen av denne sykdommen er avgjørende for å fremme den aktuelle behandlingen options.
Massespektrometri er det ideelle verktøy for å håndtere disse spørsmålene som gjør det mulig for en objektiv annotering av den kjernefysiske proteomet og relativ kvantifisering for hvordan overflod av disse proteinene endringer med sykdom. Mens det har vært flere proteomikk studier for pattedyr kjernefysiske protein komplekser, 8-13 inntil nylig 14 har det vært bare en studie som undersøker hjertets kjernefysiske proteomet, og det anses hele kjernen, snarere enn å utforske proteomet på nivået av kjernefysiske sub avdelinger . 15 I stor grad er dette mangel på arbeid på grunn av vanskeligheter med å isolere hjerte kjerner. Cardiac atomkjerner forekommer innenfor en stiv og tett aktin-myosin apparat som de er forbundet via flere forlengelser fra det endoplasmatiske retikulum, i den grad at myocyte sammentrekning endrer deres samlede form. 16 Dessuten cardiomyocytes er 40% mitokondrier volum 17 som Necessitates anrikning av kjernen bortsett fra de andre organeller. Her beskriver vi en protokoll for hjerte kjernefysisk berikelse og videre fraksjonering i biologisk relevante avdelinger. Videre har vi detaljerte metoder for label-fri kvantitativ massespektrometrisk disseksjon av disse fraksjoner-teknikker mottagelig for in vivo eksperimenter i ulike dyremodeller og organsystemer der metabolske merking er ikke gjennomførbart.
To viktigste metodene for kjernefysisk isolasjon er gjennomgått tidligere: 27 en er Behrens teknikken homogenisere lyofilisert vev i en ikke-vandig løsningsmiddel og andre, er en modifikasjon som vi bruke her, av homogenisering vev i en vandig sukrose / saltoppløsning fulgt av differensial eller tetthet-gradient sentrifugering.
Subfraksjonering av kjernene ved syreekstraksjon på vevsprøver er et viktig verktøy for å studere kromatin som har vært brukt siden 1960, 28</…
The authors have nothing to disclose.
Den Vondriska lab er støttet med tilskudd fra National Heart, Lung and Blood Institute of NIH og Laubisch Endowment ved UCLA. EM er mottaker av Jennifer S. Buchwald Graduate Fellowship i fysiologi ved UCLA, HC er mottaker av en American Heart Association Pre-doc, MP er mottaker av en NIH Ruth Kirschstein post-doc, og SF er mottaker av en NIH K99 Award.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Dulbeco Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11965 |
Protease pellet | Roche | 04 693 159 001 |
100 μm strainer | BD Falcon | 352360 |
Ultracut ultramicrotome | Reichert | |
100CX Transmission Electron Microscope |
JEOL USA, Inc. | |
Oriole | BioRad | 161-0496 |
Histone H2A antibody | Santa Cruz | sc-8648 |
Nucleoporin p62 antibody | BD Biosciences | 610498 |
Adenine nucleotide transporter antibody | Santa Cruz | sc-9299 |
BiP antibody | Santa Cruz | sc-1050 |
Tubulin antibody | Sigma | T1568 |
Histone H3 antibody | Abcam | ab1791 |
Fibrillarin antibody | Cell Signaling | C12C3 |
SNRP70 antibody | Abcam | ab51266 |
E2F-1 antibody | Thermo Fisher | MS-879 |
Retinoblastoma antibody | BD Biosciences | 554136 |
Hypoxia inducible factor-1 antibody | Novus Biologicals | NB100-469 |
BCA protein assay | Thermo Scientific | 23227 |
Reverse phase column | New Objective | PFC7515-B14-10 |
BioWorks Browser | Thermo Scientific |