Criação e injeção de<em> Manduca sexta</em> As larvas para avaliar a virulência bacteriana
Summary
O método descrito aqui utiliza a injecção directa de bactérias entomopatogênicos no hemocelo de<em> Manduca sexta</em> Larvas de insetos.<em> M. sexta</em> É um inseto disponível comercialmente e bem estudado. Assim, este método representa uma abordagem simples para analisar interacções hospedeiro-bacteriana a partir da perspectiva de um ou de ambos os parceiros.
Abstract
Manduca sexta, vulgarmente conhecido como o hornworm tabaco, é considerada uma importante praga agrícola, alimentando-se de plantas solanáceas, incluindo o tabaco e tomate. A susceptibilidade de M. sexta larvas para uma variedade de espécies bacterianas entomopatogênicos 1-5, bem como a riqueza da informação disponível sobre o sistema imunitário do insecto 6-8, e a sequência do genoma pendente 9 torná-lo um organismo modelo bom para ser utilizado no estudo de interacções hospedeiro-microorganismo durante a patogênese. Além disso, M. sexta larvas são relativamente grandes e fáceis de manipular e manter no laboratório relação a outras espécies de insetos suscetíveis. O seu grande tamanho, também facilita a extracção dos tecidos / hemolinfa eficiente para a análise da resposta do hospedeiro à infecção.
O método aqui apresentado descreve a injecção directa de bactérias no hemocelo (cavidade de sangue) de M. larvas sexta. Esta abordagempode ser utilizado para analisar e comparar as características de virulência em várias espécies bacterianas, estirpes ou mutantes, por simplesmente controlar o tempo até à morte de insectos após a injecção. Este método foi desenvolvido para o estudo da patogenicidade de Xenorhabdus Photorhabdus e espécies, que normalmente se associam com os vectores de nematóides como um meio de ganhar a entrada do insecto. Nematóides entomopatogênicos tipicamente infectar larvas através digestivo natural ou aberturas respiratórias, e liberar os seus conteúdos simbióticas bacterianas no inseto hemolinfa (sangue) pouco depois 10. O método de injecção aqui descrito evita a necessidade de um vector nemátodo, assim, desengatar os efeitos das bactérias e nematóides sobre o insecto. Este método permite a enumeração exacta de material infeccioso (células ou proteínas) dentro do inoculo, que não é possível utilizar outros métodos existentes para a análise de entomopathogenesis, incluindo nicking 11 e ensaios de toxicidade oral 12 <em>. Além disso, os ensaios de toxicidade oral abordar a virulência de toxinas segregadas introduzidos no sistema digestivo de larvas, ao passo que o método de injecção directa elimina a virulência dos inóculos de células inteiras.
A utilidade do método de injecção directa, tal como descrito aqui é analisar patogênese bacteriana por monitorização da mortalidade de insectos. No entanto, este método pode ser facilmente expandido para uso no estudo dos efeitos da infecção com o M. sexta sistema imunitário. O insecto responde à infecção por meio de ambas as respostas humoral e celular. A resposta humoral inclui o reconhecimento de bactérias associadas a padrões e subsequente produção de diversos péptidos antimicrobianos 7, a expressão de genes que codificam estes péptidos pode ser monitorizada após a infecção directa através de extração de RNA e PCR quantitativa 13. A resposta celular à infecção envolve nodulação, encapsulamento, e a fagocitose dos agentes infecciosos por hemócitos 6 </sup>. Para analisar estas respostas, insectos injectados podem ser dissecados e visualizadas por microscopia de 13, 14.
Protocol
Representative Results
Discussion
A injecção directa de M. sexta larvas com bactérias entomopatogênicos, como aqui descrito, serve como um meio simples e eficaz para analisar a virulência bacteriana. O método também é altamente adaptável para se adequar a diferentes sujeitos experimentais e / ou condições. As bactérias podem ser preparados de várias maneiras, antes da injecção. No caso de X. nematophila, células selvagens cultivadas em rico em nutrientes Luria-Bertani (LB) até meados de log-fase são tipicamente o mais…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer aos membros anteriores do laboratório Goodrich-Blair: Samantha Orchard, Kimberly Cowles, Erin Herbert-Tran, Greg Richards, Megan Menard, e Youngjin Parque por suas contribuições para o desenvolvimento deste protocolo. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation concessão IOS-0950873 e os Institutos Nacionais de Saúde NRSA comunhão FAI084441Z.
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 90 mm filter paper | Whatman | 1001 090 | |
| Glass filter holder | Millipore | XX1004700 | |
| Manduca sexta eggs | Carolina Biological Supply | 143880 | |
| Gypsy Moth Diet + agar | MP Biomedicals | 0296029301 | |
| 5.5 oz. plastic containers and lids | Solo Cup Company | URC55-0090 Pl4-0090 | |
| 1 oz. plastic containers and lids | DART Container Corporation | 100PC 100PCL25 | |
| 1x PBS | 137 mm NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4, pH 7.4 | ||
| Syringe | Hamilton | 80208 | 30 gauge, 0.375″ length, point style 2 |
References
- Bintrim, S. B., Ensign, J. C. Insertional inactivation of genes encoding the crystalline inclusion proteins of Photorhabdus luminescens results in mutants with pleiotropic phenotypes. J. Bacteriol. 180, 1261-1269 (1998).
- Schesser, J. H., Kramer, K. J., Bulla, L. A. Bioassay for homogeneous parasporal crystal of Bacillus thuringiensis using the tobacco hornworm, Manduca sexta. Appl. Environ. Microbiol. 33, 878-880 (1977).
- Péchy-Tarr, M., Bruck, D. J., Maurhofer, M., Fischer, E., Vogne, C., Henkels, M. D., Donahue, K. M., Grunder, J., Loper, J. E., Keel, C. Molecular analysis of a novel gene cluster encoding an insect toxin in plant-associated strains of Pseudomonas fluorescens. Environ. Microbiol. 10, 2368-2386 (2008).
- Nuñez-Valdez, M. E., Calderón, M. A., Aranda, E., Hernández, L., Ramírez-Gama, R. M., Lina, L., Rodríguez-Segura, Z., Gutiérrez Mdel, C., Villalobos, F. J. Identification of a putative Mexican strain of Serratia entomophila pathogenic against root-damaging larvae of Scarabaeidae (Coleoptera). Appl. Environ. Microbiol. 74, 802-810 (2008).
- Forst, S. A., Tabatabai, N. Role of the histidine kinase, EnvZ, in the production of outer membrane proteins in the symbiotic-pathogenic bacterium Xenorhabdus nematophilus. Appl. Environ. Microbiol. 63, 962-968 (1997).
- Kanost, M. R., Jiang, H., Yu, X. Q. Innate immune responses of a lepidopteran insect, Manduca sexta. Immunol. Rev. 198, 97-105 (2004).
- Yu, X. Q., Zhu, Y. F., Ma, C., Fabrick, J. A., Kanost, M. R. Pattern recognition proteins in Manduca sexta plasma. Insect Biochem. Mol. Biol. 32, 1287-1293 (2002).
- Eleftherianos, I., ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Dowling, A. J., Reynolds, S. E. Dissecting the immune response to the entomopathogen Photorhabdus. Trends Microbiol. 18, 552-560 (2010).
- Herbert, E. E., Goodrich-Blair, H. Friend and foe: the two faces of Xenorhabdus nematophila. Nat. Rev. Microbiol. 5, 634-646 (2007).
- D’Argenio, D. A., Gallagher, L. A., Berg, C. A., Manoil, C. Drosophila as a model host for Pseudomonas aeruginosa Infection. J. Bacteriol. 183, 1466-1471 (2001).
- Waterfield, N., Dowling, A., Sharma, S., Daborn, P. J., Potter, U., Ffrench-Constant, R. H. Oral toxicity of Photorhabdus luminescens W14 toxin complexes in Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 67, 5017-5024 (2001).
- Park, Y., Herbert, E. E., Cowles, C. E., Cowles, K. N., Menard, M. L., Orchard, S. S., Goodrich-Blair, H. Clonal variation in Xenorhabdus nematophila virulence and suppression of Manduca sexta immunity. Cell. Microbiol. 9, 645-656 (2007).
- Park, Y., Kim, Y., Putnam, S. M., Stanley, D. W. The bacterium Xenorhabdus nematophilus depresses nodulation reactions to infection by inhibiting eicosanoid biosynthesis in tobacco hornworms, Manduca sexta. Arch. Insect Biochem. Physiol. 52, 71-80 (2003).
- Cowles, K. N., Cowles, C. E., Richards, G. R., Martens, E. C., Goodrich-Blair, H. The global regulator Lrp contributes to mutualism, pathogenesis and phenotypic variation in the bacterium Xenorhabdus nematophila. Cell. Microbiol. 9, 1311-1323 (2007).
- Cowles, K. N., Goodrich-Blair, H. Expression and activity of a Xenorhabdus nematophila haemolysin required for full virulence towards Manduca sexta insects. Cell. Microbiol. 7, 209-219 (2005).
- Goodrich-Blair, H., Clarke, D. J. Mutualism and pathogenesis in Xenorhabdus and Photorhabdus: two roads to the same destination. Mol. Microbiol. 64, 260-268 (2007).
- Eleftherianos, I., Baldwin, H., ffrench-Constant, R. H., Reynolds, S. E. Developmental modulation of immunity: changes within the feeding period of the fifth larval stage in the defence reactions of Manduca sexta to infection by Photorhabdus. J. Insect Physiol. 54, 309-318 (2008).
- Kavanagh, K., Reeves, E. P. Exploiting the potential of insects for in vivo pathogenicity testing of microbial pathogens. FEMS Microbiol. Rev. 28, 101-112 (2004).
