Den här beskrivna metoden utnyttjar direktinsprutning av entomopatogena bakterier i hemocoel av<em> Manduca sexta</em> Insektslarver.<em> M. sexta</em> Är en kommersiellt tillgänglig och väl studerade insekt. Således representerar denna metod en enkel metod för att analysera värd-bakteriella interaktioner ur ett eller båda parter.
Manduca sexta, allmänt känd som tobak hornworm, anses vara en betydande jordbruk skadedjur, äter Solanaceae växter som tobak och tomat. Känsligheten av M. sexta larver till en mängd olika entomopatogena bakteriearter 1-5, samt mängd information som finns tillgänglig om insekten immunförsvar 6-8, och i avvaktan på arvsmassa 9 gör det till en bra modell organism för användning i studier värd-mikrob interaktioner under patogenes. Dessutom, M. sexta larver är relativt stora och lätta att manipulera och underhålla i laboratoriet i förhållande till andra mottagliga insektsarter. Sin storlek underlättar också effektiv vävnad / hemolymfa utvinning för analys av värdens svar på infektion.
Den metod som presenteras här beskriver direkt injektion av bakterier i hemocoel (blod hålighet) av M. sexta larver. Detta tillvägagångssättkan användas för att analysera och jämföra virulensen hos olika bakteriella arter, stammar eller mutanter genom att helt enkelt övervaka tiden till död insekt efter injektion. Denna metod har utvecklats för att studera sjukdomsalstrande Xenorhabdus och Photorhabdus arter, som normalt förknippar med nematod vektorer som ett sätt att få tillträde till insekten. Entomopatogena nematoder infektera normalt larver genom naturlig matsmältningssystemet eller respiratoriska öppningar, och släppa sina symbiotiska bakterier innehåll i insekten hemolymfa (blod) kort därefter 10. Injektionen här beskrivna metoden kringgår behovet av en nematod vektor, vilket frikoppling effekterna av bakterier och nematod på insekten. Denna metod tillåter en exakt räkning av infektiöst material (celler eller protein) i inokulatet, vilket inte är möjligt med andra befintliga metoder för analys entomopathogenesis inklusive nicking 11 och muntliga analyser toxicitet 12 <em>. Dessutom, oral toxicitet analyser behandla virulensen hos utsöndrade toxiner som förs in i matsmältningssystemet av larver, medan den direkta injektion metod behandlar virulens av helcells-inokulat.
Användbarheten av direkt insprutning metoden som beskrivs här är att analysera bakteriell patogenes genom övervakning insekt dödlighet. Emellertid kan denna metod lätt utvidgas för användning vid studier av effekterna av infektion på M. sexta immunsystem. Insekten svarar på infektion via både humorala och cellulära svar. Det humorala svaret innefattar erkännande av bakteriell-associerade mönster och efterföljande produktion av olika antimikrobiella peptider 7, uttrycket av gener som kodar för dessa peptider kan övervakas efter direkt infektion via RNA-extraktion och kvantitativ PCR 13. Det cellulära svar på infektion innebär nodulation, inkapsling och fagocytos av smittämnen som hemocyter 6 </sup>. För att analysera dessa svar kan injiceras insekter kan dissekeras och visualiseras genom mikroskopi 13, 14.
Den direkta injektionen av M. sexta larver med entomopatogena bakterier, som beskrivs här, fungerar som ett enkelt och effektivt sätt att analysera bakteriell virulens. Metoden är också mycket anpassningsbar för att passa olika försökspersoner och / eller förhållanden. Bakterier kan framställas på olika sätt före injektion. I fallet X. nematophila, vildtyp celler odlade i näringsrikt Luria-Bertani (LB)-medium till mitten av log-fasen är vanligtvis den mest virulenta, dödar de flesta ell…
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka tidigare medlemmar av Goodrich-Blair lab: Samantha Orchard, Kimberly Cowles, Erin Herbert-Tran, Greg Richards, Megan Menard och Youngjin Park för deras bidrag till utvecklingen av detta protokoll. Detta arbete har finansierats av National Science Foundation IOS-0950873 och National Institutes of Health NRSA gemenskap FAI084441Z.
Reagent | Company | Catalogue number | Comments |
90 mm filter paper | Whatman | 1001 090 | |
Glass filter holder | Millipore | XX1004700 | |
Manduca sexta eggs | Carolina Biological Supply | 143880 | |
Gypsy Moth Diet + agar | MP Biomedicals | 0296029301 | |
5.5 oz. plastic containers and lids | Solo Cup Company | URC55-0090 Pl4-0090 | |
1 oz. plastic containers and lids | DART Container Corporation | 100PC 100PCL25 | |
1x PBS | 137 mm NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4, pH 7.4 | ||
Syringe | Hamilton | 80208 | 30 gauge, 0.375″ length, point style 2 |