评估肾细胞蛋白激酶C同工酶，线粒体功能及细胞活力的
Summary
活化的蛋白激酶C（PKC）的同工酶与呼吸，氧化磷酸化有关的线粒体功能和对细胞活力的影响进行说明。该方法适应腺病毒技术，选择性过度表达PKC同工酶在原代培养和各种检测，以确定线粒体功能和能量状态的细胞。
Abstract
同功酶的蛋白激酶C（PKC）家族参与了许多生理和病理过程。我们最近的数据表明，PKC调节线粒体的功能和细胞能量状态。许多报告表明激活PKC-αPKC-ε提高在缺血性心脏的线粒体功能和介导的心脏保护作用。相反，我们已经表明，PKC-α和PKC-ε参与在nephrotoxicant诱导的线粒体功能障碍和肾脏细胞中的细胞死亡。因此，本研究的目标是开发PKC同工酶可以选择性地激活或抑制，以确定其氧化磷酸化和细胞生存的调节作用，保持积极的线粒体功能的肾细胞的体外模型。培养更好的条件，导致线粒体线粒体呼吸和活动的原代培养肾小管上皮细胞（RPTC）线粒体酶类似于那些在RPTC 体内 。由于传统的转染技术（脂质体转染，电穿孔）在原代培养中是低效的，对线粒体功能产生不利影响，PKC-ε突变cDNA分别传递到RPTC通过腺病毒载体。这种做法的结果转染培养RPTC超过90％。
在这里，我们提出了评估的作用，PKC-ε的方法：1。调节线粒体形态和ATP合成，和2与相关联的功能。 RPTC在小学文化的生存期。由过度的组成性激活PKC-ε突变激活PKC-ε。 PKC-ε抑制过度的无效突变体的PKC-ε。线粒体功能的评估是通过检查呼吸，呼吸链的完整性，活动，呼吸复合物和F 0 F 1-ATP酶，ATP生成率和ATP含量。呼吸是ssessed的毛地黄皂苷-透性RPTC状态3（最大呼吸中存在的多余的基板和ADP）和非耦合呼吸。呼吸链的完整性进行评估，通过测量所有4个配合物中分离线粒体呼吸链的活动。氧化磷酸化的能力的评价通过测定线粒体膜电位，ATP生成率，和F 0 F 1-ATP酶的活性。的RPTC的能源状况进行评估，确定细胞内ATP含量。在活细胞中的线粒体形态可视化使用Mitotracker有红580，专门蓄积在线粒体内的荧光染料，和活的单层，在荧光显微镜下检查。 RPTC可行性评估采用膜联蛋白V /碘化丙啶染色后流式细胞仪测定细胞凋亡和胀亡。
这些方法允许在个别的PKC同功酶的选择性激活/禁止，以评估它们的作用，在细胞功能中的各种生理和病理条件，可以在体外再现。
Protocol
Representative Results
Discussion
这里介绍的方法允许个人同工酶的PKC的过度表达在肾小管上皮细胞的原代培养的。这种方法有几个优势：1。它允许在一个同质的人口调查监管机制的细胞（肾小管上皮细胞），各种损伤（缺血，缺氧，氧化应激），药物和nephrotoxicants肾脏内的主要目标。 2。 在体外模型的RPTC生长在原代培养条件的改善线粒体功能，在这个类似于肾近曲小管在体内的线粒体功能。1,2 3。线粒体?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是由美国国家卫生研究院，美国国立糖尿病，消化和肾脏疾病，2R01DK59558（GN）的资助。 UAMS翻译研究所流式细胞仪核心提供了部分资金支持由国立卫生国家研究资源中心授予UL1 RR029884在UAMS。我们感谢沛沛平博士（加州大学洛杉矶分校，洛杉矶，CA）提供的一份腺病毒携带基因编码的显性负（无效）突变体的PKC-ε和，艾伦博士Samarel（Loyola大学医学中心;梅伍德，IL），用于提供一个等分PKC-ε的组成型活性的突变体的腺病毒载体编码。我们也感谢博士。彼得·帕克和彼得·萨格登（伦敦帝国学院，伦敦，英国）组成性激活PKC-ε的cDNA编码。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Laminar flow hood | Thermo Electron Corporation | FORMA 1104 |
| 2 ml and 15 ml Dounce tissue grinder | WHEATON | 989-24607, 357544 |
| 85 and 235 micron nylon mesh | Small Parts | CMN – 0085 – 10YD CMN – 0250 – 10YD |
| 50 ml sterile centrifuge tube | BIOLOGIX | BCT-P 50BS |
| 1.5 ml micro tube | Sarstedt | 72.690.001 |
| 35 x 10 mm sterile culture dishes | Corning | 430165 |
| Jouan Centrifuge | Jouan | Jouan CR3 11175704 Rotors: Jouan T40 |
| Adjustable micro-centrifuge | SIGMA | Model 1 – 15 |
| Biological Oxygen Monitor | YSI Incorporated | YSI Model 5300A |
| Single Chamber Micro Oxygen System | YSI Incorporated | 5356S |
| Oxygen Probe | YSI Incorporated | 5331A |
| Circulating Bath | YSI Incorporated | 5310 |
| KCl and Standard Membrane Kit | YSI Incorporated | 5775 |
| Magnetic Stirrer | YSI Incorporated | 5222 |
| Flatbed Recorder | Kipp & Zonen | BD 11E |
| 48-well and 96-well transparent plates | Costar | 3548, 3679 |
| Thermomixer R | Eppendorf | 5355 21919 |
| Orbital shaker MAXQ 2000 | Thermo Scientific | SHKA 2000 |
| Spectra FLUOR Plus (absorbance/fluorescence/luminescence reader) | Tecan | F129005 |
| Water-Jacketed US Autoflow Automatic CO2 Incubator | NUAIRE | NU 4850 |
| 12×75 mm polystyrene culture test tubes for flow cytometry | Fisher Brand | 14-961-20 |
| Axioskop Water immersion objective 63x / 0,90W |
Carl Zeiss | 114846 ACHROPLAN 44 00 67 |
| DMEM / F12 | Cellgro | 99 – 830 – PB |
| DMEM / F12 Ham | Sigma | D 2906 – 1L |
| Deferoxamine Mesylate | Hospira | D110 |
| Collagenase Type I | Worthington | 4196 |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T 6522 – 500mg |
| 5,5′,6,6′-tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide (JC-1) | Invitrogen | T3168 |
| Mitotracker Red | Invitrogen | M22425 |
| ATP Bioluminescence Assay Kit HS II | Roche | 11 699 709 001 |
| Annexin V – FITC solution | BioVision | 1001 – 200 |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD FACSCalibur |
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