הערכה של פונקציות מיטוכונדריאלי וכדאיויות תא בתאי כלית overexpressing חלבון קינאז C Isozymes
Summary
את ההשפעות של הפעלה של קינאז isozymes חלבון C (PKC) על תפקוד המיטוכונדריה קשורים בנשימה וזרחון חמצונים ועל כדאיויות תא מתוארות. הגישה מסתגלת טכניקת adenoviral סלקטיבי overexpress isozymes PKC בתרבית תאים ראשוניים ומגוון של מבחנים כדי לקבוע פונקציות המיטוכונדריה ומצב אנרגיה של התא.
Abstract
משפחת חלבוני קינאז C (PKC) של isozymes מעורבת בתהליכים פיסיולוגיים ופתולוגיים רבים. הנתונים האחרונים שלנו מראים כי PKC מווסת את התפקוד המיטוכונדריה ומצב אנרגיה בתאים. דיווחים רבים הראו שההפעלה של PKC-PKC-ε ומשפרת את התפקוד המיטוכונדריה בלב איסכמית וcardioprotection המתווך. בניגוד לכך, יש לנו הראו כי PKC-α וPKC-ε מעורב בתפקוד nephrotoxicant מושרה המיטוכונדריה ומוות של תאים בתאי כליה. לכן, מטרתו של מחקר זה הייתה לפתח מודל במבחנה של תאי כלית שמירה על תפקודי המיטוכונדריה פעילים שביכולה להיות מופעלים על isozymes PKC סלקטיבי או עכבות כדי לקבוע את תפקידם ברגולציה של זירחון חמצונים והישרדות תאים. תרבויות העיקריות של תאים צינוריים הפרוקסימלי כליה (RPTC) היו בתרבית בתנאים משופרים וכתוצאה מכך הנשימה ופעילות המיטוכונדריאלי של מיטואנזימים דומים לאלה בRPTC in vivo chondrial. בגלל טכניקות מסורתיות (transfection Lipofectamine, electroporation) אינן יעילות בתרבויות העיקריות ויש לו השפעות שליליות על תפקוד המיטוכונדריה, PKC-ε cDNAs מוטציה נמסר לRPTC באמצעות וקטורי adenoviral. תוצאות גישה זו בtransfection של מעל 90% RPTC התרבותי.
כאן, אנו מציגים שיטות להערכת תפקידו של PKC-ε ב: 1. רגולציה של מורפולוגיה ופונקציות הקשורות לסינתזת ATP, ו 2 המיטוכונדריה. הישרדות של RPTC בתרבות העיקרית. PKC-ε מופעל על ידי overexpressing constitutively הפעיל PKC-ε המוטציה. PKC-ε מעוכב מוטציה לא הפעילה של ε-PKC ידי overexpressing. מיטוכונדריה מוערכת על ידי בחינת נשימה, שלמות של שרשרת הנשימה, פעילות של תסביכים ונשימת F נ 0 1-ATPase, קצב ייצור ה-ATP, ותוכן ה-ATP. נשימה היאssessed בdigitonin-permeabilized RPTC כ3 מדינה (נשימה מרבית בנוכחות מצעים וADP עודפים) ונשימות כשהתיר. שלמות של שרשרת הנשימה מוערכת על ידי מדידת פעילותם של כל הארבעה הקומפלקסים של שרשרת הנשימה במיטוכונדריה המבודדת. קיבולת של זירחון חמצונים מחושבת על ידי מדידת פוטנציאל הקרום המיטוכונדריה, קצב ייצור ה-ATP, ופעילות של F נ 0 1-ATPase. מצב אנרגיה של RPTC מוערך על ידי קביעת תוכן ATP התאי. מורפולוגיה מיטוכונדריאלי בתאים חיים היא מדמיינת באמצעות MitoTracker אדום 580, צבע פלואורסצנטי המצטבר במיוחד במיטוכונדריה, וmonolayers החי נבחנים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. כדאיות RPTC הוערכה באמצעות annexin V / מכתים יודיד propidium אחרי cytometry זרימה לקבוע אפופטוזיס וoncosis.
שיטות אלו מאפשרות הפעלה / עיכוב בררנית של PKC isozymes פרטכדי להעריך את תפקידם בתפקודים תאיים במגוון רחב של מצבים פיסיולוגיים ופתולוגיים, שניתן לשכפל במבחנה.
Protocol
Representative Results
Discussion
הגישה שהוצגה כאן מאפשרת לביטוי יתר של isozymes הבודד של PKC בתרבות העיקרית של תאים צינוריים הפרוקסימלי כליה. ישנם מספר יתרונות של גישה זו: 1. זה מאפשר לחקר מנגנוני ויסות באוכלוסייה הומוגנית של תאים (תאים צינוריים הפרוקסימלי כליות) שהמטרה העיקרית לעלבונות שונים (איסכמיה, מת?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהמכון הלאומי לבריאות, המכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות, 2R01DK59558 (לGN). UAMS Translational מכון מחקר הנתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות המרכז הלאומי לחקר משאבי מענק UL1 RR029884 ספק מימון חלקי לליבת cytometry זרימה ב UAMS. אנו מודים לד"ר Peipei פינג (אוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג'לס; לוס אנג'לס, קליפורניה) למתן aliquot של אדנווירוס ביצוע קידוד המוטציה דומיננטית שלילית (לא פעיל) של PKC-ε וד"ר אלן Samarel (אוניברסיטה לויולה מרכז רפואי cDNA; Maywood, אילינוי) למתן aliquot של וקטור adenoviral קידוד מוטצית constitutively הפעילה של PKC-ε. אנו מודים גם לבני זוג. פיטר פארקר ופיטר סאגד (אימפריאל קולג' בלונדון, לונדון, בריטניה) עבור מתן קידוד constitutively PKC-ε פעיל cDNA.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Laminar flow hood | Thermo Electron Corporation | FORMA 1104 |
| 2 ml and 15 ml Dounce tissue grinder | WHEATON | 989-24607, 357544 |
| 85 and 235 micron nylon mesh | Small Parts | CMN – 0085 – 10YD CMN – 0250 – 10YD |
| 50 ml sterile centrifuge tube | BIOLOGIX | BCT-P 50BS |
| 1.5 ml micro tube | Sarstedt | 72.690.001 |
| 35 x 10 mm sterile culture dishes | Corning | 430165 |
| Jouan Centrifuge | Jouan | Jouan CR3 11175704 Rotors: Jouan T40 |
| Adjustable micro-centrifuge | SIGMA | Model 1 – 15 |
| Biological Oxygen Monitor | YSI Incorporated | YSI Model 5300A |
| Single Chamber Micro Oxygen System | YSI Incorporated | 5356S |
| Oxygen Probe | YSI Incorporated | 5331A |
| Circulating Bath | YSI Incorporated | 5310 |
| KCl and Standard Membrane Kit | YSI Incorporated | 5775 |
| Magnetic Stirrer | YSI Incorporated | 5222 |
| Flatbed Recorder | Kipp & Zonen | BD 11E |
| 48-well and 96-well transparent plates | Costar | 3548, 3679 |
| Thermomixer R | Eppendorf | 5355 21919 |
| Orbital shaker MAXQ 2000 | Thermo Scientific | SHKA 2000 |
| Spectra FLUOR Plus (absorbance/fluorescence/luminescence reader) | Tecan | F129005 |
| Water-Jacketed US Autoflow Automatic CO2 Incubator | NUAIRE | NU 4850 |
| 12×75 mm polystyrene culture test tubes for flow cytometry | Fisher Brand | 14-961-20 |
| Axioskop Water immersion objective 63x / 0,90W |
Carl Zeiss | 114846 ACHROPLAN 44 00 67 |
| DMEM / F12 | Cellgro | 99 – 830 – PB |
| DMEM / F12 Ham | Sigma | D 2906 – 1L |
| Deferoxamine Mesylate | Hospira | D110 |
| Collagenase Type I | Worthington | 4196 |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T 6522 – 500mg |
| 5,5′,6,6′-tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide (JC-1) | Invitrogen | T3168 |
| Mitotracker Red | Invitrogen | M22425 |
| ATP Bioluminescence Assay Kit HS II | Roche | 11 699 709 001 |
| Annexin V – FITC solution | BioVision | 1001 – 200 |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD FACSCalibur |
References
- Nowak, G., Schnellmann, R. G. Improved culture conditions stimulate gluconeogenesis in primary cultures of renal proximal tubule cells. Am. J. Physiol. 268, C1053-C1061 (1995).
- Nowak, G., Schnellmann, R. G. L-ascorbic acid regulates growth and metabolism of renal cells: improvements in cell culture. Am. J. Physiol. 271, 2072-2080 (1996).
- Ping, P., Takano, H., Zhang, J., Tang, X. L., Qiu, Y., Li, R. C., Banerjee, S., Dawn, B., Balafonova, Z., Bolli, R. Isoform-selective activation of protein kinase C by nitric oxide in the heart of conscious rabbits: a signaling mechanism for both nitric oxide-induced and ischemia-induced preconditioning. Circ. Res. 84, 587-604 (1999).
- Wotton, D., Ways, D. K., Parker, P. J., Owen, M. J. Activity of both Raf and Ras is necessary for activation of transcription of the human T cell receptor beta gene by protein kinase C, Ras plays multiple roles. J. Biol. Chem. 268, 17975-17982 (1993).
- Nowak, G., Bakajsova, D., Samarel, A. M. Protein kinase C-ε activation induces mitochondrial dysfunction and fragmentation in renal proximal tubules. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 301, F197-F208 (2011).
- Nowak, G., Clifton, G. L., Godwin, M. L., Bakajsova, D. Activation of ERK1/2 pathway mediates oxidant-induced decreases in mitochondrial function in renal cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 291, 840-855 (2006).
- Shaik, Z. P., Fifer, E. K., Nowak, G. Akt activation improves oxidative phosphorylation in renal proximal tubular cells following nephrotoxicant injury. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 294, F423-F432 (2008).
- Nowak, G. Protein kinase C-α and ERK1/2 mediate mitochondrial dysfunction, decreases in active Na+ transport, and cisplatin-induced apoptosis in renal cells. J. Biol. Chem. 277, 43377-43388 (2002).
- Liu, X., Godwin, M. L., Nowak, G. Protein kinase C- a inhibits the repair of oxidative phosphorylation after S-(1,2-dichlorovinyl)-L-cysteine injury in renal cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 287, F64-F73 (2004).
- Nowak, G., Price, P. M., Schnellmann, R. G. Lack of a functional p21WAF1/CIP1 gene accelerates caspase-independent apoptosis induced by cisplatin in renal cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 285, F440-F450 (2003).
- Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. Cisplatin-induced renal cell apoptosis: caspase 3-dependent and -independent pathways. J. Pharmacol. Exp. Ther. 302, 8-17 (2002).
