Vurdering av Mitokondrielle funksjoner og celleviabilitet i nyre celler ved overuttrykk Protein C isozymer
Summary
Virkningene av aktivering av proteinkinase C (PKC)-isozymene på mitokondrielle funksjoner knyttet respirasjon og oksidativ fosforylering og på cellelevedyktighet beskrives. Tilnærmingen tilpasser adenovirale teknikk for selektivt overuttrykker PKC isozymer i primær cellekultur og en rekke analyser for å bestemme mitokondrielle funksjoner og energi status av cellen.
Abstract
Proteinkinase C (PKC) familie av isoenzymer er involvert i en rekke fysiologiske og patologiske prosesser. Våre siste data viser at PKC regulerer mitokondriefunksjon og cellulær energi status. Tallrike rapporter viste at aktiveringen av PKC-a og PKC-ε forbedrer mitokondriell funksjon i iskemisk hjertesykdom og medierer kardioproteksjon. Derimot har vi vist at PKC-α og PKC-ε er involvert i nephrotoxicant-indusert mitokondriell dysfunksjon og celledød i nyre celler. Derfor var målet med denne studien å utvikle en in vitro modell av renale celler opprettholde aktive mitokondrie funksjoner som PKC isozymer kunne selektivt aktivert eller hemmet å bestemme sin rolle i regulering av oksidativ fosforylering og celle overlevelse. Primære kulturer av renale proksimale tubulære celler (RPTC) ble dyrket i bedre forhold som resulterer i mitokondrie åndedrett og aktivitet av Mitochondrial enzymer ligner på dem i RPTC in vivo. Fordi tradisjonelle transfeksjon teknikker (Lipofectamine, electroporation) er ineffektive i grunnskolen kulturer og ha negative effekter på mitokondrienes funksjon, ble PKC-ε mutant cDNA'ene levert til RPTC gjennom adenovirale vektorer. Denne tilnærmingen fører transfeksjon av over 90% kultivert RPTC.
Her presenterer vi metoder for å vurdere rollen som PKC-ε i: 1. regulering av mitokondriell morfologi og funksjoner knyttet ATP syntese, og 2. overlevelse av RPTC i primær kultur. PKC-ε aktiveres av overekspresjon den konstitutivt aktiv PKC-ε mutant. PKC-ε hemmes av overekspresjon den inaktive mutant av PKC-ε. Mitokondriefunksjon vurderes ved å undersøke åndedrett, integritet respiratoriske kjeden, aktiviteter respiratoriske komplekser og F 0 F 1-ATPase, ATP produksjonsrate, og ATP innhold. Respirasjon er enssessed i digitonin-permeabilized RPTC som stat 3 (maksimum åndedrett i nærvær av overflødig underlag og ADP) og uncoupled respirations. Integritet respiratoriske kjeden vurderes ved å måle aktiviteter av alle fire komplekser av respiratoriske kjeden i isolerte mitokondrier. Kapasitet på oksidativ fosforylering blir evaluert ved å måle mitokondrie membran potensial, ATP produksjonsrate, og aktiviteten F 0 F 1-ATPase. Energi status RPTC vurderes ved å bestemme den intracellulære ATP innhold. Mitokondrie morfologi i levende celler er visualisert ved hjelp av MitoTracker 580 Rød, et fluorescerende fargestoff som spesifikt akkumuleres i mitokondriene, og live monolayers er undersøkt under et fluorescerende mikroskop. RPTC levedyktighet blir vurdert ved Annexin V / propidium iodide flekker etterfulgt av flowcytometri å bestemme apoptose og oncosis.
Disse metodene tillater en selektiv aktivering / inhibering av individuelle PKC isozymerå vurdere deres rolle i cellulære funksjoner i en rekke fysiologiske og patologiske tilstander som kan reproduseres in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tilnærmingen presenteres her muliggjør overekspresjon av individuelle isozymer av PKC i primær kultur av renale proksimale tubulære celler. Det er flere styrker av denne tilnærmingen: 1. Det gir mulighet for å undersøke reguleringsmekanismer i en homogen befolkning av celler (renal proksimale tubulære celler) som er det primære målet for ulike fornærmelser (iskemi, hypoksi, oksidativt stress), narkotika og nephrotoxicants innenfor nyrene. 2. Mitokondrielle funksjoner i denne in vitro modell av RPTC d…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra National Institutes of Health, National Institute of Diabetes og Digestive og nyre sykdommer, 2R01DK59558 (til GN). UAMS translasjonsforskning Research Institute støttet av National Institutes of Health National Center for Research Resources stipend UL1 RR029884 gitt delfinansiering for flowcytometri Kjerne på UAMS. Vi takker Dr. Peipei Ping (University of California i Los Angeles, Los Angeles, CA) for å gi en delmengde av adenovirus bærer cDNA koding den dominerende negative (inaktive) mutant av PKC-ε og Dr. Allen Samarel (Loyola University Medical Center; Maywood, IL) for å tilveiebringe en porsjon av adenovirusvektor koding konstitutivt aktiv mutant av PKC-ε. Vi vil også takke Drs. Peter Parker og Peter Sugden (Imperial College London, London, UK) for å gi cDNA som koder konstitutivt aktive PKC-ε.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Laminar flow hood | Thermo Electron Corporation | FORMA 1104 |
| 2 ml and 15 ml Dounce tissue grinder | WHEATON | 989-24607, 357544 |
| 85 and 235 micron nylon mesh | Small Parts | CMN – 0085 – 10YD CMN – 0250 – 10YD |
| 50 ml sterile centrifuge tube | BIOLOGIX | BCT-P 50BS |
| 1.5 ml micro tube | Sarstedt | 72.690.001 |
| 35 x 10 mm sterile culture dishes | Corning | 430165 |
| Jouan Centrifuge | Jouan | Jouan CR3 11175704 Rotors: Jouan T40 |
| Adjustable micro-centrifuge | SIGMA | Model 1 – 15 |
| Biological Oxygen Monitor | YSI Incorporated | YSI Model 5300A |
| Single Chamber Micro Oxygen System | YSI Incorporated | 5356S |
| Oxygen Probe | YSI Incorporated | 5331A |
| Circulating Bath | YSI Incorporated | 5310 |
| KCl and Standard Membrane Kit | YSI Incorporated | 5775 |
| Magnetic Stirrer | YSI Incorporated | 5222 |
| Flatbed Recorder | Kipp & Zonen | BD 11E |
| 48-well and 96-well transparent plates | Costar | 3548, 3679 |
| Thermomixer R | Eppendorf | 5355 21919 |
| Orbital shaker MAXQ 2000 | Thermo Scientific | SHKA 2000 |
| Spectra FLUOR Plus (absorbance/fluorescence/luminescence reader) | Tecan | F129005 |
| Water-Jacketed US Autoflow Automatic CO2 Incubator | NUAIRE | NU 4850 |
| 12×75 mm polystyrene culture test tubes for flow cytometry | Fisher Brand | 14-961-20 |
| Axioskop Water immersion objective 63x / 0,90W |
Carl Zeiss | 114846 ACHROPLAN 44 00 67 |
| DMEM / F12 | Cellgro | 99 – 830 – PB |
| DMEM / F12 Ham | Sigma | D 2906 – 1L |
| Deferoxamine Mesylate | Hospira | D110 |
| Collagenase Type I | Worthington | 4196 |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T 6522 – 500mg |
| 5,5′,6,6′-tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide (JC-1) | Invitrogen | T3168 |
| Mitotracker Red | Invitrogen | M22425 |
| ATP Bioluminescence Assay Kit HS II | Roche | 11 699 709 001 |
| Annexin V – FITC solution | BioVision | 1001 – 200 |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD FACSCalibur |
References
- Nowak, G., Schnellmann, R. G. Improved culture conditions stimulate gluconeogenesis in primary cultures of renal proximal tubule cells. Am. J. Physiol. 268, C1053-C1061 (1995).
- Nowak, G., Schnellmann, R. G. L-ascorbic acid regulates growth and metabolism of renal cells: improvements in cell culture. Am. J. Physiol. 271, 2072-2080 (1996).
- Ping, P., Takano, H., Zhang, J., Tang, X. L., Qiu, Y., Li, R. C., Banerjee, S., Dawn, B., Balafonova, Z., Bolli, R. Isoform-selective activation of protein kinase C by nitric oxide in the heart of conscious rabbits: a signaling mechanism for both nitric oxide-induced and ischemia-induced preconditioning. Circ. Res. 84, 587-604 (1999).
- Wotton, D., Ways, D. K., Parker, P. J., Owen, M. J. Activity of both Raf and Ras is necessary for activation of transcription of the human T cell receptor beta gene by protein kinase C, Ras plays multiple roles. J. Biol. Chem. 268, 17975-17982 (1993).
- Nowak, G., Bakajsova, D., Samarel, A. M. Protein kinase C-ε activation induces mitochondrial dysfunction and fragmentation in renal proximal tubules. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 301, F197-F208 (2011).
- Nowak, G., Clifton, G. L., Godwin, M. L., Bakajsova, D. Activation of ERK1/2 pathway mediates oxidant-induced decreases in mitochondrial function in renal cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 291, 840-855 (2006).
- Shaik, Z. P., Fifer, E. K., Nowak, G. Akt activation improves oxidative phosphorylation in renal proximal tubular cells following nephrotoxicant injury. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 294, F423-F432 (2008).
- Nowak, G. Protein kinase C-α and ERK1/2 mediate mitochondrial dysfunction, decreases in active Na+ transport, and cisplatin-induced apoptosis in renal cells. J. Biol. Chem. 277, 43377-43388 (2002).
- Liu, X., Godwin, M. L., Nowak, G. Protein kinase C- a inhibits the repair of oxidative phosphorylation after S-(1,2-dichlorovinyl)-L-cysteine injury in renal cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 287, F64-F73 (2004).
- Nowak, G., Price, P. M., Schnellmann, R. G. Lack of a functional p21WAF1/CIP1 gene accelerates caspase-independent apoptosis induced by cisplatin in renal cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 285, F440-F450 (2003).
- Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. Cisplatin-induced renal cell apoptosis: caspase 3-dependent and -independent pathways. J. Pharmacol. Exp. Ther. 302, 8-17 (2002).
