Evaluación de las funciones mitocondriales y la viabilidad celular renal de células que sobreexpresan la proteína quinasa C Isoenzimas
Summary
Los efectos de la activación de la proteína quinasa C (PKC) las isoenzimas en las funciones mitocondriales asociadas con la respiración y la fosforilación oxidativa y en la viabilidad celular se describen. El enfoque se adapta técnica adenoviral para sobreexpresar selectivamente las isozimas de la PKC en cultivo de células primarias y una diversidad de ensayos para determinar las funciones mitocondriales y el estado de energía de la célula.
Abstract
La proteína quinasa C (PKC), la familia de isoenzimas está implicado en numerosos procesos fisiológicos y patológicos. Nuestros datos recientes demuestran que la PKC regula la función mitocondrial y estado de energía celular. Numerosos informes demuestran que la activación de la PKC-a y PKC-ε mejora la función mitocondrial en el corazón isquémico y media la cardioprotección. En contraste, se ha demostrado que la PKC-α y PKC ε-están implicados en nephrotoxicant inducida por disfunción mitocondrial y la muerte celular en células de riñón. Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue desarrollar un modelo de vitro de células renales que mantienen activas las funciones mitocondriales en los que las isoenzimas PKC podría ser selectivamente activados o inhibidos para determinar su papel en la regulación de la fosforilación oxidativa y la supervivencia celular. Los cultivos primarios de células renales tubulares proximales (POCT) se cultivaron en condiciones mejoradas resultantes en la respiración mitocondrial y la actividad de Mitoenzimas mitocondriales similares a los de POCT in vivo. Debido a las técnicas tradicionales de transfección (Lipofectamine, electroporación) son ineficientes en cultivos primarios y tienen efectos adversos sobre la función mitocondrial, PKC-ε ADNc mutantes fueron entregados a través de POCT vectores adenovirales. Este enfoque implica la transfección de más del 90% RPTC culto.
A continuación, se presentan los métodos para evaluar el papel de la PKC-ε en: 1. regulación de la morfología mitocondrial y funciones asociadas con la síntesis de ATP, y 2. supervivencia de POCT en cultivo primario. PKC-ε es activada por la sobreexpresión constitutivamente activa PKC-ε mutante. PKC-ε es inhibida por la sobreexpresión del mutante inactivo de la PKC-ε. La función mitocondrial se evalúa mediante el examen de la respiración, la integridad de la cadena respiratoria, actividades de complejos respiratorios y F 0 F 1-ATPasa, la tasa de producción de ATP, y el contenido de ATP. La respiración es unssessed en digitonina-permeabilizadas POCT como el estado 3 (respiración máxima en presencia de exceso de sustratos y ADP) y las respiraciones no acoplados. Integridad de la cadena respiratoria se evaluó midiendo las actividades de los cuatro complejos de la cadena respiratoria en las mitocondrias aisladas. Capacidad de la fosforilación oxidativa se evalúa midiendo el potencial de membrana mitocondrial, la tasa de producción de ATP, y la actividad de F 0 F 1-ATPasa. El estado de energía de POCT se evalúa mediante la determinación del contenido intracelular de ATP. Morfología mitocondrial en células vivas se visualizaron usando MitoTracker Red 580, un colorante fluorescente que se acumula específicamente en las mitocondrias, y las monocapas en vivo se examina bajo un microscopio de fluorescencia. Viabilidad RPTC se evalúa utilizando anexina V / yoduro de propidio tinción seguido por citometría de flujo para determinar la apoptosis y oncosis.
Estos métodos permiten una activación selectiva / inhibición de las isoenzimas PKC individuopara evaluar su papel en las funciones celulares en una variedad de condiciones fisiológicas y patológicas que pueden ser reproducidos en in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
El enfoque aquí presentado permite la sobreexpresión de isoenzimas individuales de la PKC en el cultivo primario de las células tubulares renales proximales. Hay varias ventajas de este enfoque: 1. Permite la investigación de los mecanismos de regulación en una población homogénea de células (células tubulares renales proximales) que son el objetivo principal de diversos insultos (isquemia, hipoxia, estrés oxidativo), drogas y nephrotoxicants dentro del riñón. 2. Funciones mitocondriales en este mod…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por una beca de los Institutos Nacionales de Salud, Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales, 2R01DK59558 (para GN). UAMS Traslacional del Instituto de Investigación financiado por los Institutos Nacionales de Salud Centro Nacional para la Investigación de los Recursos subvención UL1 RR029884 proporcionó financiación parcial para Core Citometría de Flujo en UAMS. Agradecemos al Dr. Peipei Ping (Universidad de California en Los Angeles, Los Angeles, CA) para proporcionar una alícuota de adenovirus que lleva el ADNc que codifica el dominante negativo (inactivo) mutante de PKC-ε y el Dr. Allen Samarel (Loyola University Medical Center; Maywood, IL) para proporcionar una alícuota de vector adenoviral que codifica el mutante constitutivamente activa de PKC-ε. También queremos agradecer a los Dres. Peter Parker y Peter Sugden (Imperial College London, Londres, Reino Unido) para proporcionar cDNA que codifica constitutivamente activa PKC-ε.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Laminar flow hood | Thermo Electron Corporation | FORMA 1104 |
| 2 ml and 15 ml Dounce tissue grinder | WHEATON | 989-24607, 357544 |
| 85 and 235 micron nylon mesh | Small Parts | CMN – 0085 – 10YD CMN – 0250 – 10YD |
| 50 ml sterile centrifuge tube | BIOLOGIX | BCT-P 50BS |
| 1.5 ml micro tube | Sarstedt | 72.690.001 |
| 35 x 10 mm sterile culture dishes | Corning | 430165 |
| Jouan Centrifuge | Jouan | Jouan CR3 11175704 Rotors: Jouan T40 |
| Adjustable micro-centrifuge | SIGMA | Model 1 – 15 |
| Biological Oxygen Monitor | YSI Incorporated | YSI Model 5300A |
| Single Chamber Micro Oxygen System | YSI Incorporated | 5356S |
| Oxygen Probe | YSI Incorporated | 5331A |
| Circulating Bath | YSI Incorporated | 5310 |
| KCl and Standard Membrane Kit | YSI Incorporated | 5775 |
| Magnetic Stirrer | YSI Incorporated | 5222 |
| Flatbed Recorder | Kipp & Zonen | BD 11E |
| 48-well and 96-well transparent plates | Costar | 3548, 3679 |
| Thermomixer R | Eppendorf | 5355 21919 |
| Orbital shaker MAXQ 2000 | Thermo Scientific | SHKA 2000 |
| Spectra FLUOR Plus (absorbance/fluorescence/luminescence reader) | Tecan | F129005 |
| Water-Jacketed US Autoflow Automatic CO2 Incubator | NUAIRE | NU 4850 |
| 12×75 mm polystyrene culture test tubes for flow cytometry | Fisher Brand | 14-961-20 |
| Axioskop Water immersion objective 63x / 0,90W |
Carl Zeiss | 114846 ACHROPLAN 44 00 67 |
| DMEM / F12 | Cellgro | 99 – 830 – PB |
| DMEM / F12 Ham | Sigma | D 2906 – 1L |
| Deferoxamine Mesylate | Hospira | D110 |
| Collagenase Type I | Worthington | 4196 |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T 6522 – 500mg |
| 5,5′,6,6′-tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide (JC-1) | Invitrogen | T3168 |
| Mitotracker Red | Invitrogen | M22425 |
| ATP Bioluminescence Assay Kit HS II | Roche | 11 699 709 001 |
| Annexin V – FITC solution | BioVision | 1001 – 200 |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD FACSCalibur |
References
- Nowak, G., Schnellmann, R. G. Improved culture conditions stimulate gluconeogenesis in primary cultures of renal proximal tubule cells. Am. J. Physiol. 268, C1053-C1061 (1995).
- Nowak, G., Schnellmann, R. G. L-ascorbic acid regulates growth and metabolism of renal cells: improvements in cell culture. Am. J. Physiol. 271, 2072-2080 (1996).
- Ping, P., Takano, H., Zhang, J., Tang, X. L., Qiu, Y., Li, R. C., Banerjee, S., Dawn, B., Balafonova, Z., Bolli, R. Isoform-selective activation of protein kinase C by nitric oxide in the heart of conscious rabbits: a signaling mechanism for both nitric oxide-induced and ischemia-induced preconditioning. Circ. Res. 84, 587-604 (1999).
- Wotton, D., Ways, D. K., Parker, P. J., Owen, M. J. Activity of both Raf and Ras is necessary for activation of transcription of the human T cell receptor beta gene by protein kinase C, Ras plays multiple roles. J. Biol. Chem. 268, 17975-17982 (1993).
- Nowak, G., Bakajsova, D., Samarel, A. M. Protein kinase C-ε activation induces mitochondrial dysfunction and fragmentation in renal proximal tubules. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 301, F197-F208 (2011).
- Nowak, G., Clifton, G. L., Godwin, M. L., Bakajsova, D. Activation of ERK1/2 pathway mediates oxidant-induced decreases in mitochondrial function in renal cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 291, 840-855 (2006).
- Shaik, Z. P., Fifer, E. K., Nowak, G. Akt activation improves oxidative phosphorylation in renal proximal tubular cells following nephrotoxicant injury. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 294, F423-F432 (2008).
- Nowak, G. Protein kinase C-α and ERK1/2 mediate mitochondrial dysfunction, decreases in active Na+ transport, and cisplatin-induced apoptosis in renal cells. J. Biol. Chem. 277, 43377-43388 (2002).
- Liu, X., Godwin, M. L., Nowak, G. Protein kinase C- a inhibits the repair of oxidative phosphorylation after S-(1,2-dichlorovinyl)-L-cysteine injury in renal cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 287, F64-F73 (2004).
- Nowak, G., Price, P. M., Schnellmann, R. G. Lack of a functional p21WAF1/CIP1 gene accelerates caspase-independent apoptosis induced by cisplatin in renal cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 285, F440-F450 (2003).
- Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. Cisplatin-induced renal cell apoptosis: caspase 3-dependent and -independent pathways. J. Pharmacol. Exp. Ther. 302, 8-17 (2002).
