Denna metod undersöker trombocyt-medierad hopklumpning fenotypen av<em> Plasmodium falciparum</em>-Infekterade erytrocyter (PRBC) i kliniska isolat. Detta görs genom att isolera och co-inkubation blodplättsrik plasma och en suspension av PRBC.
P. falciparum orsakar majoriteten av svåra infektionerna. De patofysiologiska mekanismerna bakom cerebral malaria (CM) är inte helt klarlagda och flera hypoteser har lagts fram, bland annat mekanisk obstruktion av mikrokärl av P. falciparum-parasiterade röda blodkroppar (PRBC). Faktum är att under den intra-erytrocytiska skede av dess livscykel, P. falciparum har den unika förmågan att modifiera ytan av den infekterade erytrocyter genom att exportera ytantigener med varierande vidhäftande egenskaper på RBC membranet. Detta möjliggör upptag av PRBC i flera vävnader och organ genom adhesion till endotelceller kantar mikrovaskulaturen av post-kapillära venoler 1. Genom att göra så, de mogna formerna av parasiten undvika mjälten clearance av den deformerade infekterade erytrocyter 2 och begränsar deras miljö till en mer gynnsam låg syrehalt tryck 3. Som en konsekvens av denna SEQUESTranson, det är bara omogna asexuella parasiter och gametocyter som kan detekteras i perifert blod.
Cytoadherence och upptag av mogna PRBC till de många värd receptorer som uttrycks på mikrovaskulära sängar sker i svår och okomplicerad sjukdom. Men flera rader av bevis tyder på att endast specifika självhäftande fenotyper kommer sannolikt att vara associerad med svåra patologiska resultat av malaria. Ett exempel på sådana specifika värd-parasit interaktioner har påvisats in vitro, där förmågan av intracellulär adhesionsmolekyl-1 att stödja bindning av PRBC med särskilda vidhäftande egenskaper har kopplats till utvecklingen av cerebral malaria 4,5. Moderkakan har också erkänts som ett område av företrädesrätt PRBC ackumulering i malaria-smittade gravida kvinnor, med chondrotin sulfat A uttrycks på syncytiotrophoblasts som kantar moderkakan intervillous utrymmet som den viktigaste receptorn 6. Rosettering av PRBC to infekterade erytrocyter via komplement receptor 1 (CD35) 7,8 har också satts i samband med allvarlig sjukdom 9.
En av de senast beskrivna P. falciparum cytoadherence fenotyper är förmågan hos PRBC att bilda trombocyt-medierade klumpar in vitro. Bildningen av sådana PRBC klumpar kräver CD36, ett glykoprotein som uttrycks på ytan av trombocyter. En annan mänsklig receptor, gC1qR/HABP1/p32, uttryckt på olika celltyper inklusive endotelceller och trombocyter, har också visat sig underlätta PRBC vidhäftning på trombocyter att bilda klumpar 10. Vare klumpar uppkommer in vivo är fortfarande oklart, men det kan vara orsaken till den betydande ackumulering av blodplättar beskrivs i hjärnan mikrocirkulation av malawiska barn som dog av CM 11. Dessutom möjligheten för kliniska isolat kulturer att klampa in vitro var direkt kopplade till sjukdomens svårighetsgrad i malawiskt 12 </sup> Och moçambikiska patienter 13, (även om inte i maliska 14).
Med flera aspekter av PRBC klampa fenotypen dåligt karakteriserad, har pågående studier i denna fråga inte följt ett standardiserat förfarande. Detta är en viktig fråga på grund av den kända hög variabilitet inneboende i analysen 15. Här presenterar vi en metod för in vitro plätt-medierad klampa av P. falciparum med hopp om att det kommer att ge en plattform för en konsekvent metod för andra grupper och öka medvetenheten om de begränsningar i att undersöka denna fenotyp i framtida studier. Att vara baserade i Malawi, ger vi ett protokoll som utformats särskilt för en begränsad resurs inställning, med den fördelen att nyuppsamlade kliniska isolat kan undersökas fenotyp utan behov av frysförvaring.
Vi har beskrivit en plätt-medierad klumpar analys används för att studera PRBC i kliniska isolat direkt i fält. Trombocyt-medierad klumpar, en karakteristisk beteende i P. falciparum kliniska isolat, har identifierats som en distinkt lim fenotyp, ofta i CD36-bindande isolat 12,23-24. Vi har använt denna analys för att identifiera tre huvudpunkter: 1) En stark in vitro klumpar fenotypen av P. falciparum isolerad från malawiska barn som är associerade med sjukdomens svårighetsgrad och diagnos 2) nya receptor P-selektin mediaties klumpar på blodplättar tillsammans med CD36, 3) graden av trombocytopeni närvarande i tålmodig med CM är tillräcklig för att begränsa ytterligare bildning av PRBC klumpar i vitro 12. Medverkan av blodplättar i klumpar bildas demonstreras genom att undersöka en våt-preparatet som beskrivs i avsnitt 6. Trombocyter kan isoleras från PRP genom centrifugering vid höga hastigheterFör att minimera blod reaktioner grupp antigena, men använde vi hela PRP för att minimera tidig blodplättaktivering från överdriven hantering och från höghastighetscentrifugering. Platelet aktivitet kan mätas genom trombocytaggregation test med användning av svaga trombocyt agonister, epinefrin eller adenosindifosfat (ADP) 25 såsom beskrivs i 26.
Det finns flera aspekter av den analys som tidigare har dåligt karakteriserade, en av dem är vikten av att välja PRP källor och effekten av blodgrupper antigen om resultatet av analysen. Vi förberedde PRP från personer som var blodgrupp O + och hade inte tagit någon medicin under de senaste 7-10 dagarna innan blod dras eftersom vissa läkemedel kan påverka trombocyt beteende.
Andra faktorer som kan påverka klumpar framgång inkluderar PRBC hematokrit, jämnar parasitaemi och längd klumpar analysen. Använda hög hematokrit och trombocyter coUNT skulle det vara svårt att avgöra om klustret är verkligen en klump eller om alltför många celler bara sitta tillsammans eftersom de är tätt packade 15. Clumping också i allmänhet ökar med längre inkubationstider. Dessa är alla användbara riktlinjer som bör beaktas när man utformar klumpar studier.
Vi finner att prover från olika kliniska grupper kan analyseras parallellt med PRP från samma donator om det är möjligt att göra det, men i begränsad resurs inställningar såsom fältstationer transfusionen poolen är i allmänhet begränsad. Det är därför svårt att ha en enda O + donator att standardisera analyserna. Vi identifierade därför flera o + givare för att säkerställa kompatibilitet blodgrupp möjligt. Använda flera givare är också till hjälp i fall av stora prover storlekar så att bördan av blodgivning inte faller på en enda individ.
Provtagningspunkter 15-20 min är mycket mer möjligt om en enda person genomför analyserna, vilket möjliggör wet-bildspel preparat och utföra assay kinetik utan provtagning gånger överlappande. De flesta av den mikroskopiska data visuellt och något mål, och därför är det viktigt att cellräkning verifieras av mer än en person. I så fall, kan hantera ett prov taget tillåta fullständig analys av tre till fyra prover per dag beroende på personlig effektivitet.
Platelet-medierad klumpning kan utföras med användning av både kliniska och laboratorie-isolat. För laboratorium linjer, rekommenderas det att CD36 bindande parasiter används för att maximera klumpar frekvenser. Analysen kan kopplas med andra agglutinationsanalyser såsom rosettering eller användas i clumping inhiberingsanalyser som skulle göra det möjligt att studera receptorer på blodplättar som kan mediera PRBC bindning, en dåligt känd och undersökt aspekt av denna fenotyp.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har möjliggjorts genom finansiering från Wellcome Trust. JM (080.964) och SCW (080.948) stöddes av Wellcome Trust, stipendier och DT med Malawi-Liverpool-Wellcome Trust studentship.
Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
RPMI 1640 | Invitrogen | 21870-092 | |
Acridine orange | Invitrogen | A3568 | 10 mg/ml |
Gelofusine | B Braun | Gelofusine | |
1 M HEPES | Invitrogen | 15630 | |
Gentamycin | Invitrogen | 15750045 | 50 mg/ml |
Albumax | GIBCO | 1102-037 | |
Sodium citrate vacutainer | BD | 362760 | 4 ml capacity |
Inverted Microscope | Leica | MD16000 B | |
Fluorescent microscope | Leica | EL6000 | Contains blue and green light fluorescent filters for acridine orange and ethidium bromide |