Qui si descrive un metodo per l'attivazione ed espandere cellule NKT dal bulk popolazioni di cellule T usando cellule presentanti antigene artificiali (AAPC). L'uso di CD1d basata AAPC fornisce un metodo standard per la generazione di numeri elevati di cellule NKT funzionali.
Natural killer T (NKT) cellule sono un sottogruppo di cellule T che visualizzano marcatori caratteristici di entrambi natural killer (NK) e le cellule T 1. Diversamente classici cellule T, cellule NKT riconoscono antigeni lipidi nel contesto di molecole CD1 2. Cellule NKT esprimere un riarrangiamento catena invariante TCRα: Vα14Jα18 in topi e Vα24Jα18 nell'uomo, che è associata con catene Vβ limitata diversità di 3-6, e sono indicati come canoniche o invarianti NKT (i NKT) cellule. Simile a cellule T convenzionali, cellule NKT sviluppano da cellule precursori CD4-CD8-T timici seguendo la segnalazione appropriata CD1d 7. Il potenziale di utilizzare cellule NKT per scopi terapeutici è aumentato significativamente la capacità di stimolare ed espandere cellule NKT con α-Galactosylceramide (α-GalCer) e una varietà di citochine 8. È importante sottolineare che queste cellule mantenuto il loro originale phenotype, citochine secrete e visualizzata funzione citotossica contro linee cellulari tumorali. Così, espanse ex vivo cellule NKT rimanere funzionale e può essere utilizzato per l'immunoterapia adottiva. Tuttavia, cellule NKT based-immunoterapia è stato limitato con l'uso di cellule che presentano l'antigene autologhe e la quantità e la qualità di queste cellule stimolatrici può variare sostanzialmente. DC derivate da monociti di pazienti affetti da cancro sono stati segnalati per esprimere livelli ridotti di molecole costimolatorie e producono citochine infiammatorie meno 9,10. Infatti, DC murine anziché APC autologhe sono stati utilizzati per testare la funzione delle cellule NKT da pazienti CML 11. Tuttavia, questo sistema può essere utilizzato solo per la sperimentazione in vitro cellule NKT poiché non può essere espansa murino DC e quindi utilizzati per l'immunoterapia adottiva. Quindi, un sistema standardizzato che si basa su cellule artificiali Antigen Presenting (AAPC) potrebbe produrre gli effetti stimolanti della DC senza le insidie di allo-o xenogeniche ceLLS 12, 13. Qui, si descrive un metodo per generare CD1d basata AAPC. Poiché l'impegno del recettore delle cellule T (TCR) di CD1d-antigene è un requisito fondamentale di attivazione delle cellule NKT, antigene: CD1d-Ig complessi forniscono un metodo affidabile per isolare, attivare, ed espandere popolazioni di cellule effettrici NKT.
AAPC possono essere utilizzati per studiare i requisiti di base per l'attivazione delle cellule NKT e ha il potenziale valore clinico per l'espansione ex vivo di cellule NKT per immunoterapia adottiva. Mescher et al. Descritto uno dei primi sistemi basati tallone, dove murino biotinilato classe MHC-peptide-singoli costrutti catena sono stati combinati con molecole costimolatorie biotinilati B7.1 e B7.2 tramite streptavidina alla superficie delle microsfere lattice 14, 15. Questo approccio è stato utilizzato con successo per stimolare cellule T antigene-specifiche di topi transgenici. Inoltre, poiché questo approccio utilizza una singola catena MHC-peptide per garantire loading omogenea delle molecole MHC, ciascun antigene peptide desiderato richiederebbe una nuova trasfezione per l'espressione della singola catena desiderata MHC-peptide, limitando così la generalità di approccio. È importante sottolineare che il gruppo del Dr. Schneck ha aperto la strada al tallone based-AAPC, attraverso lo sviluppo di un altro non cellulare AAPC tallone base, Realizzato accoppiando HLA-Ig, segnale 1, e anti-CD28, segnale 2, su biglie magnetiche. HLA-Ig, una forma unica multimerica di HLA fusa ad una immunoglobulina patibolo molecolare 16, 17 è stata sviluppata dal suo gruppo. Successivamente, hanno sviluppato MHC-Ig basata AAPC, che hanno dimostrato di espandere efficacemente CMV e MART-1 specifica CTL 18. Qui, abbiamo dimostrato che CD1d-Ig AAPC base può essere utilizzato per espandere cellule NKT funzionali. Uno studio ha utilizzato un sistema simile per esaminare l'interazione fisica delle cellule NK con CD1d 19.
In particolare, abbiamo progettato una cellula artificiale presentanti l'antigene che è adattabile a qualsiasi esigenza troviamo necessaria per ottimizzare la proliferazione delle cellule NKT. Il metodo di espansione AAPC fornisce un metodo semplice e affidabile per estendere e arricchire cellule NKT. Il nostro AAPC può essere modificato per valutare sistematicamente il ruolo di un gruppo di molecole di costimolazione potenziali e valutare il loro ruolo sulla proliferazione delle cellule NKTzione e la funzione. Così, AAPC rappresentano una tecnologia robusta versatile utile per l'induzione e l'espansione delle cellule NKT. La generazione di aAPCs richiede meno di una settimana ed è adatto per la produzione di grandi quantità di perle. Tuttavia, un passo critico nel generare il AAPC è confermare che CD1d-Ig è stabilmente immobilizzato sulla superficie delle perle e valutare la loro funzionalità di coerenza da lotto a lotto. Un limite potenziale del sistema è che non vi è un meccanismo atto a spegnere stimolazione, oltre rimozione meccanica delle perle. Specificamente, l'impegno del recettore delle cellule T (TCR) con l'antigene: complesso CD1d/MHC generano tipicamente sinapsi immunologica in concerto con accessori / molecole di adesione, che può provocare l'induzione di fattori inibitori o soppressiva sia sulla cellula T e cellule presentanti l'antigene. Nel sistema AAPC, questi fattori possono essere upregulated dalla cellula T, ma il tallone non si esprimono i ligandi congiuntiper questi recettori.
Inoltre, le cellule CD4 + NKT hanno dimostrato di sopprimere le risposte antitumorali nei topi e umani, quindi è possibile che l'attivazione non selettivo di tutte le cellule NKT stimolazione (cioè globale con α-GalCer) o attivazione del sottoinsieme errato potrebbe provocare indesiderati immunologica risultati. Di conseguenza, si deve fenotipicamente e funzionalmente caratterizzano la AAPC espanso popolazione di cellule NKT. Come mostrato in figura 4, abbiamo trovato che la stimolazione con α-GalCer-loaded AAPC esprimere anti-CD28 può provocare cellule NKT producono Th1, Th2 e citochine di tipo Th17. Studi murini hanno riportato che sfida con IL-33, una citochina recentemente identificato, portato a un aumento dei livelli circolanti di citochine infiammatorie come IL-5 e IL-13. Trattamento di cellule NKT con IL-33 potenziato la loro produzione di citochine 20. IL-33 è un ligando specifico per ST2 ed è stato dimostrato che ST2 solubile can blocchi IL-33 di segnalazione. Quindi, come esempio di una futura applicazione, ST2 AAPC esprimendo potrebbe essere generato e utilizzato per determinare se si potesse inibire selettivamente la produzione di citochine Th2 mentre induce secrezione di citochine da Th1 cellule NKT. E 'stato anche riportato che l'iniezione iv di Kb-AAPC esprimere in topi C57BL / 6 provocato metastasi polmonari ridotte del tumore 21. Importante, questi dati dimostrano che il traffico AAPC al polmone e sono in grado di attivare cellule T effettrici sottoinsiemi. Pertanto, si potrebbe generare diversi tipi di AAPC ed esaminare l'interazione tra sottopopolazioni di cellule T antigene specifiche. Per riassumere, questi studi dimostrano che CD1d-Ig AAPC base può essere utilizzato per sostituire normale APC cellulare, e hanno il potenziale per migliorare attuali approcci clinici per cellule NKT based-immunoterapia adottiva.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori desiderano ringraziare Priyanka Subrahmanyam per le discussioni utili. Gli autori non hanno concorrenti interesse finanziario. Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti della American Cancer Society, NIH / NCI K01 CA131487, CA162273 R21, R21 CA162277, P30 e immunologia dei tumori e Programma di Immunoterapia TJ Webb. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non necessariamente rappresentano le opinioni ufficiali del National Cancer Institute e il National Institutes of Health.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Ficoll-Paque PLUS | GE Life Sciences | 17-1440 | |
EasySep Human T Cell Enrichment Kit | StemCell Technologies | 19051 | |
Allophycocyanin CD161 human mAb | Pharmingen | 550968 | |
EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18002 | |
Anti-mouse IgG1 Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-047-101 | |
Dimer XI Recombinant Soluble Dimeric Mouse CD1d:IG Fusion Protein | BD Biosciences | 557599 | |
Anti-CD28 mAb | Biolegend | 302914 | |
M-450 Epoxy beads | Life Technologies | 150-11 | |
Alpha-galactosylceramide (KRN7000) | Axxora, LLC | BML-SL232-0100 | |
RPMI 1640 Medium | Sigma Aldrich | R 0883 | |
Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
Non-essential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
Vitamin Solution | Gibco | 11120-052 | |
2-mercaptoethanol | Gibco | ||
Ciprofloxacin | Alexis Biochemicals | 380-288-G025 | |
PE-Vα24Jα18 | Biolegend | 342904 | |
PE-Vα24 (Clone C15) | Beckman Coulter | A66907 | |
FITC-Vβ11 (Clone C21) | Beckman Coulter | A66905 | |
PE-CD1d | Biolegend | 123510 | |
PE anti mouse IgG1 | BD Biosciences | 556650 | |
FITC anti-mouse IgG2a | Biolegend | 407105 | |
DPBS, no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190250 | |
Sodium Azide | Sigma Aldrich | S8032 | |
Bovine Serum Albumin | American Bioanalytical | AB00440-00100 | |
EDTA | Sigma Aldrich | 431788 | |
IL-2 (Proleukin) | BD Biosciences | 354043 | |
Human AB Serum | Atlanta Biologicals | S40110 | |
Labquake Tube Rotator | Fisher Scientific | 13-687-10Q | |
BD Falcon 5 ml polystyrene round-bottom tubes | Fisher Scientific | 14-959-1A | |
Wheaton Glass Sample Vials with Cap | Fisher Scientific | Small (03-343-6A ) Large (03-343-6E) |