मानव pluripotent स्टेम सेल से एक Multititre प्लेट प्रारूप में न्यूरॉन्स की तेजी से और कुशल जनरेशन
Summary
Pluripotent मानव स्टेम कोशिकाओं के neuronal भेदभाव (hPSCs) के लिए प्रोटोकॉल अक्सर समय लेने वाली और पर्याप्त सेल संस्कृति कौशल की आवश्यकता होती है. यहाँ, हम एक multititre प्लेट प्रारूप के लिए एक छोटा सा अणु आधारित भेदभाव प्रक्रिया को अनुकूलित किया है, एक नियंत्रित तरीके से मानव न्यूरॉन्स की सरल, तेजी से और कुशल पीढ़ी की इजाजत दी.
Abstract
मानव pluripotent स्टेम सेल (hPSCs) से न्यूरॉन्स की पीढ़ी के लिए मौजूदा प्रोटोकॉल अक्सर कठिन है कि वे multistep अलगाव और तंत्रिका कोशिकाओं के अग्रदूत विस्तार पहले टर्मिनल भेदभाव शामिल प्रक्रियाओं हैं. इन समय लेने वाली दृष्टिकोण की तुलना में, हम हाल ही में पाया है कि तीन संकेत दे रास्ते, TGFβ/SMAD2, BMP/SMAD1, और FGF / ERK, संयुक्त निषेध hPSCs, कार्यात्मक न्यूरॉन्स में तत्काल भेदभाव द्वारा पीछा neuroectoderm की तेजी से प्रेरण को बढ़ावा देता है. यहाँ, हम एक उपन्यास multititre प्लेट प्रारूप हमारे प्रक्रिया को अनुकूलित किया है, आगे अपनी reproducibility बढ़ाने के लिए और यह मध्य throughput अनुप्रयोगों के साथ संगत बनाने के. यह अस्थायी (embryoid निकायों) क्षेत्रों, पक्षपाती की शर्तों के तहत न्यूरॉन्स में भेदभाव का एक और चार दिनों के द्वारा पीछा में neuroectoderm गठन के चार दिनों के शामिल हैं. ज्यादातर इस प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त कोशिकाओं द्विध्रुवी संवेदी न्यूरॉन्स दिखाई देते हैं. इसके अलावा,अत्यधिक कुशल प्रक्रिया है, विशेष रूप से विशेषज्ञ कौशल की आवश्यकता नहीं है, और लागत कुशल छोटे अणुओं के साथ एक सरल रासायनिक परिभाषित मध्यम पर आधारित है. इन सुविधाओं के कारण प्रक्रिया आगे कार्यात्मक जांच के लिए एक उपयोगी मंच के रूप में के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सेल आधारित स्क्रीनिंग मानव संवेदी न्यूरॉन्स या किसी भी प्रकार के न्यूरॉन्स की आवश्यकता के दृष्टिकोण के लिए सेवा कर सकते हैं.
Introduction
hPSCs, जिसमें भ्रूण व्युत्पन्न मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) और प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSCs), pluripotent अर्थ है कि वे 1-2 इन विट्रो में विभिन्न सेल प्रजातियों को जन्म दे सकते हैं कर रहे हैं. कई विभेदित सेल प्रकार तिथि करने के लिए hESCs से प्राप्त किया गया है, धारणा है कि इन कोशिकाओं को वैज्ञानिक अनुसंधान और सेल आधारित स्क्रीनिंग दृष्टिकोण के लिए मूल्यवान उपकरण मौजूद है, और सेल आधारित चिकित्सा विज्ञान के लिए वादा पकड़ का समर्थन.
HESCs के लिए Neuronal भेदभाव प्रोटोकॉल आम तौर पर कर रहे हैं जटिल और समय लेने के रूप में वे अक्सर पहली उत्प्रेरण समग्र तंत्रिका भाग्य, तंत्रिका progenitors के मैनुअल, अलगाव और 3-6 ब्याज की एक दिया न्यूरॉन प्रकार में बाद टर्मिनल भेदभाव द्वारा पीछा किया पर आधारित हैं. कुछ संबंध में, यह आश्चर्य की बात है और अपरिहार्य जटिलता दिया है कि इस तरह के राज्य के कला निर्देशित भेदभाव प्रोटोकॉल stepwise के लिए करते हैं जल्दी मानव विकास है, जो की नकल नहीं हैज अपने आप में बेहद जटिल है. दूसरी ओर, यह भी भाग में अंतर्निहित आणविक प्रक्रियाओं के बारे में हमारी समझ की कमी को प्रतिबिंबित कर सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप भेदभाव प्रोटोकॉल है कि अभी भी पूरी तरह से अनुकूलित किया जा रहा से दूर कर रहे हैं में.
में neuroectoderm, Pera एट अल में undifferentiated hPSCs के रूपांतरण के लिए संबंध के साथ. पाया गया है कि बीएमपी / SMAD1/5/8 संकेतन के दमन 7 hESCs के तंत्रिका प्रेरण को बढ़ाता है. इसके अलावा, / 3 SMAD2 संकेतन की निष्क्रियता के neuroectoderm 8 गठन को बढ़ावा देने के दिखाया गया है. तदनुसार, इन दो रास्ते में से एक संयुक्त निष्क्रियता और अधिक कुशल 4,9 hPSCs के तंत्रिका प्रेरण करने के लिए नेतृत्व करने के लिए जाता है. हाल ही में, हम पता चला है कि एक तिहाई संकेतन मार्ग, FGF / ERK, hESCs में जल्द से जल्द neuroectodermal प्रतिबद्धता के इस कदम का एक मजबूत repressor के रूप में कार्य करता है. इसके विपरीत, इन सभी तीन रास्ते के साथ – साथ दमन neuroectoderm में साथ hESCs के रूपांतरण के पास सजातीय नेतृत्वसिर्फ चार 10 दिनों में. बाद में, अत्यधिक कुशल कार्यात्मक न्यूरॉन्स में टर्मिनल भेदभाव आठ दिनों के भीतर मनाया गया. प्राप्त न्यूरॉन्स परिधीय तंत्रिका तंत्र, जो भाग में उनके तेजी से 10 व्युत्पत्ति समझा जा सकता है के संवेदी न्यूरॉन्स होने की संभावना थे. संवेदी न्यूरॉन रखरखाव में दोष पारिवारिक dysautonomia 11 के रूप में इस तरह के कुछ मानव विकारों का एक कारण माना जाता है. जैसे hiPSC 12 प्रौद्योगिकी पर आधारित आगे कार्यात्मक लक्षण वर्णन के लिए, रोगों, साथ ही लागू न्यूरॉन्स के किसी विशेष प्रकार की आवश्यकता नहीं प्रयोजनों के लिए अच्छी तरह से मॉडलिंग के लिए, इस भेदभाव की प्रक्रिया एक उपयोगी आधार मौजूद हो सकता है.
हालांकि, भेदभाव रणनीति हम मूल hESC 10 कालोनियों के clumps से भ्रूण के शरीर के शामिल गठन (यूके) में कार्यरत हैं, और यह काफी EB आकार के बारे में विविधता के एक डिग्री में हुई है, और भी कुछ CE में न्यूरॉन गठन दक्षता समझौता दिखाईकरूँगा लाइनों. इसके अलावा, EB आकार में विविधता के कारण, व्यवस्थित न्यूरॉन गठन के दौरान और बाद में अतिरिक्त वृद्धि कारक या छोटे अणुओं के प्रभाव का परीक्षण करने की क्षमता के लिए कुछ हद तक चकित हो दिखाई दिया.
इस रिपोर्ट में, हम मध्यम throughput संगत, मजबूर एकत्रीकरण आधारित तकनीक के लिए एक अत्यधिक आकार नियंत्रित तरीके में ईबीएस उत्पन्न करने के लिए हमारे पिछले प्रक्रिया रूपांतरित किया है, के रूप में भी 13 अन्य संदर्भों में दिखाया. इसके बाद, ईबीएस 96-अच्छी तरह से प्लेटों के वी के आकार कुओं U-आकार अल्ट्रा कम लगाव 96 अच्छी तरह प्लेटें हस्तांतरित में उत्पन्न करने के लिए निलंबन में neuroectoderm गठन आरंभ. चार दिन बाद, ईबीएस टर्मिनली विभेदित उच्च दक्षता और एकरूपता पर न्यूरॉन्स को जन्म देने के बाहर चढ़ाया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, दिन-4 ईबीएस एकल कक्षों में अलग थे और बाहर के रूप में इस तरह के, जिसके परिणामस्वरूप मानव न्यूरॉन्स के कम घनत्व monolayers में चढ़ाया. सुसंगत परिणाम इस प्रकार अब तक दो स्वतंत्र रूप से डी के साथ प्राप्त थेrived hESC लाइनों, HuES6 और NCL3.
एक शर्त के रूप में सफल EB गठन कड़ाई से एक सिंथेटिक बहुलक, polyvinyl शराब (PVA) के उपयोग पर निर्भर रॉक अवरोध करनेवाला वाई 27,632 hESC 13-14 अस्तित्व को बढ़ावा देने के लिए जाना जाता था, के साथ मिलकर. नतीजतन, ईबीएस की एकरूपता 96-V प्लेटों में गठित ईबीएस के बड़े पैमाने पर यादृच्छिक बंटवारे तकनीक पर आधारित संस्कृतियों के रूप में गठन के लिए तुलना में काफी हद तक बढ़ाया गया था. यह प्रणाली इस प्रकार निलंबन संस्कृति में neuroectoderm गठन, अत्यधिक नियंत्रित पक्षपाती शर्तों के तहत न्यूरॉन गठन द्वारा पीछा के लिए एक महत्वपूर्ण सुधार मंच प्रदान करता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
अधिकांश भेदभाव हमारे पहले प्रकाशित की प्रक्रिया 10 सहित hPSCs, से EB गठन से जुड़े प्रोटोकॉल मैनुअल या समुच्चय है, जो अनिवार्य रूप से EB आकार में विविधता की ओर जाता है के रूप में hESCs एंजाइम की मदद से की कटाई पर …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के मैक्स प्लैंक सोसायटी द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Matrigel HC | Becton Dickinson | 354263 | See text for details on handling |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 21331-020 | |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma | 363170 | Dissolve at 0.4% in DMEM/F-12 using an ultrasonic waterbath / avoid overheating / can be kept at 4 °C for several weeks |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502-048 | 100X, store as frozen aliquots |
| B27 Supplement | Life Technologies | 12587-010 | 50X, store as frozen aliquots |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A1595 | 10% = 500X, store as frozen aliquots |
| L-Glutamine with Penicillin / Streptomycin | PAA | P11-013 | Or equivalent |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | Dissolve at 10 μg/ml in 0.1% BSA / PBS = 1000X, store as frozen aliquots |
| ROCK inhibitor Y-27632 | abcamBiochemicals | Asc-129 | Dissolve at 10 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| PBS | PAA | H15-002 | Or equivalent |
| Accutase | PAA | L11-007 | |
| 96-well V-bottom plates | Nunc | 277143 | |
| PD0325901 | Axon Medchem | Axon 1408 | Dissolve at 0.5 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| SB431542 | abcamBiochemicals | Asc-163 | dissolve at 15 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| Dorsomorphin | Santa Cruz | sc-200689 | dissolve at 0.5 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| 96-well U-bottom ultra-low attachment plates | Corning | 7007 | |
| beta-III Tubulin antibody (mouse) | Sigma | T8660 | use at 1:1000 |
| beta-III Tubulin antibody (rabbit) | Covance | PRB-435P | use at 1:2000 |
| BRN3A (POU4F1) antibody | Santa Cruz | sc-8429 | use at 1:500 |
| Table 1. Specific reagents and equipment. |
References
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