तर्क, प्रायोगिक कदम, और Heterologous प्राकृतिक उत्पाद biosynthesis के संभावित परिसर एंटीबायोटिक एक के माध्यम से उत्पादन इरीथ्रोमाइसीन<em> ई. कोलाई</em
Summary
इरिथ्रोमाइसिन एक heterologous के माध्यम से biosynthesis<em> ई. कोलाई</em, 2) heterologous पुनर्गठन, और 3) उत्पाद विश्लेषण 1) आनुवंशिक स्थानांतरण:> निम्नलिखित प्रयोगात्मक कदम भी शामिल है. हर कदम चिकित्सीय प्राकृतिक उत्पादों के उत्पादन का उपयोग करने में प्रेरणा, क्षमता, और चुनौतियों के संदर्भ में विस्तार से बताया जाएगा<em> ई. कोलाई</em> एक किराए की मेजबान के रूप में.
Abstract
The heterologous production of complex natural products is an approach designed to address current limitations and future possibilities. It is particularly useful for those compounds which possess therapeutic value but cannot be sufficiently produced or would benefit from an improved form of production. The experimental procedures involved can be subdivided into three components: 1) genetic transfer; 2) heterologous reconstitution; and 3) product analysis. Each experimental component is under continual optimization to meet the challenges and anticipate the opportunities associated with this emerging approach.
Heterologous biosynthesis begins with the identification of a genetic sequence responsible for a valuable natural product. Transferring this sequence to a heterologous host is complicated by the biosynthetic pathway complexity responsible for product formation. The antibiotic erythromycin A is a good example. Twenty genes (totaling >50 kb) are required for eventual biosynthesis. In addition, three of these genes encode megasynthases, multi-domain enzymes each ~300 kDa in size. This genetic material must be designed and transferred to E. coli for reconstituted biosynthesis. The use of PCR isolation, operon construction, multi-cystronic plasmids, and electro-transformation will be described in transferring the erythromycin A genetic cluster to E. coli.
Once transferred, the E. coli cell must support eventual biosynthesis. This process is also challenging given the substantial differences between E. coli and most original hosts responsible for complex natural product formation. The cell must provide necessary substrates to support biosynthesis and coordinately express the transferred genetic cluster to produce active enzymes. In the case of erythromycin A, the E. coli cell had to be engineered to provide the two precursors (propionyl-CoA and (2S)-methylmalonyl-CoA) required for biosynthesis. In addition, gene sequence modifications, plasmid copy number, chaperonin co-expression, post-translational enzymatic modification, and process temperature were also required to allow final erythromycin A formation.
Finally, successful production must be assessed. For the erythromycin A case, we will present two methods. The first is liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) to confirm and quantify production. The bioactivity of erythromycin A will also be confirmed through use of a bioassay in which the antibiotic activity is tested against Bacillus subtilis. The assessment assays establish erythromycin A biosynthesis from E. coli and set the stage for future engineering efforts to improve or diversify production and for the production of new complex natural compounds using this approach.
Introduction
इरीथ्रोमाइसीन एक एक polyketide ग्राम पॉजिटिव मिट्टी के जीवाणु Saccharopolyspora erythraea द्वारा उत्पादित एंटीबायोटिक है, और वर्तमान उत्पादन संवर्द्धित पारंपरिक mutagenesis और स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल के दशकों के माध्यम से और अधिक हाल ही में अनुकूलन प्रक्रिया 1-6 योजनाओं के माध्यम से किया गया है ~ 10 जी / एल सुधार. Mutagenesis और स्क्रीनिंग रणनीतियों एंटीबायोटिक प्राकृतिक उत्पाद विकास में संवर्धन और / में कठिनाइयों का एक परिणाम के रूप में या आनुवंशिक देशी उत्पादन मेजबान से छेड़छाड़ और आसानी से उपलब्ध एंटीबायोटिक गतिविधि या बेहतर विकास के लिए चयन सहायता phenotypes क्योंकि आम हैं. इरिथ्रोमाइसिन ए, एस के मामले में erythraea एक धीमी गति से विकास प्रोफ़ाइल और अधिक प्रत्यक्ष आनुवंशिक हेरफेर तकनीक (ई. कोलाई जैसे जीवों की तुलना में) की कमी के द्वारा सीमित है, इस प्रकार, उत्पादन और नए डेरिवेटिव के biosynthesis में तेजी से सुधार में बाधा. उत्पादन मुद्दों को मान्यता दी और diversificati खुलाइरिथ्रोमाइसिन एक तरह यौगिकों के साथ संभावनाओं पर अनुसंधान समुदाय heterologous (1 चित्रा) biosynthesis 7 के विचार को आगे बढ़ाने के लिए शुरू किया. इन प्रयासों इरिथ्रोमाइसिन एक जीन 8-11 क्लस्टर के लिए उपलब्ध अनुक्रम जानकारी के साथ आया. यह जोर दिया जाना चाहिए कि अनुक्रम जटिल प्राकृतिक उत्पाद जीन समूहों की संख्या बहुत 12-16 का विस्तार किया गया है, निरंतर प्रयासों heterologous biosynthesis में इनकोडिंग औषधीय क्षमता का उपयोग करने के लिए प्रोत्साहन प्रदान करते हैं. ऐसा करने, heterologous पुनर्गठन की आवश्यकता है कि नए मेजबान विशिष्ट biosynthetic मार्ग की जरूरतों को पूरा ई.. कोलाई तकनीकी सुविधा, आणविक जीव विज्ञान तकनीक की एक विस्तृत फैले सेट, और चयापचय और प्रक्रिया इंजीनियरिंग उत्पाद विकास के लिए रणनीति प्रदान करता है. फिर भी, जब देशी उत्पादन मेजबान, ई. की तुलना कोलाई जटिल प्राकृतिक उत्पाद के उत्पादन का एक ही स्तर का प्रदर्शन नहीं करता. इसलिए यह अज्ञात था ई है कि क्या. कोलाई जटिल प्राकृतिक उत्पाद biosynthesis के लिए एक व्यवहार्य heterologous विकल्प के रूप में सेवा कर सकता है. हालांकि, यह मान लिया था कि ई. कोली को एक आदर्श मेजबान जीव अगर heterologous biosynthesis पूरा किया जा सकता होगा.
मन में इस लक्ष्य के साथ प्रारंभिक प्रयासों के लिए 6-deoxyerythronolide (6dEB बी) polyketide aglycone ई. के माध्यम से उत्पादन शुरू कर दिया कोलाई. हालांकि, देशी ई. कोलाई चयापचय propionyl सीओए प्रशंसनीय स्तर प्रदान नहीं और (2S) methylmalonyl सीओए व्यापारियों 6dEB biosynthesis के समर्थन की जरूरत है और न ही नए मेजबान के बाद translationally deoxyerythronolide बी (DEBS) synthase एंजाइमों को संशोधित कर सकता सकता है. इन मुद्दों के उपाय करने के लिए, एक चयापचय देशी और heterologous एंजाइमों का बना मार्ग ई. में बनाया गया था ऐसे कोलाई exogenously खिलाया propionate कि intracellularly propionyl सीओए परिवर्तित कर दिया गया और फिर (2S) methylmalonyl सीओए, इस मार्ग को पूरा करने के लिए इंजीनियरिंग के दौरान, एक sfp जीन वें में रखा गया थाई. की ई गुणसूत्र कोलाई BL21 (DE3) एक नई नस्ल का उत्पादन BAP1 कहा जाता है. SFP एंजाइम DEBS 17,18 एंजाइमों को 4'-phosphopantetheine cofactor संलग्न की एक phosphopantetheinyl transferase सक्षम है. तीन DEBS जीन (प्रत्येक ~ 10 केबी) तो दो अलग – अलग चयन अभिव्यक्ति युक्त inducible प्रमोटरों T7 वैक्टर पर रखा गया. प्रेरण के बाद तापमान (22 डिग्री सेल्सियस) की एक प्रमुख समायोजन करने के बाद, DEBS जीन coordinately एक सक्रिय राज्य में 19 6dEB पैदा करने में सक्षम थे, BAP1 भीतर व्यक्त की है.
पूर्ण इरिथ्रोमाइसिन की खोज एक biosynthesis फिर से एक अनुरूप जीन समूह Micromonospora megalomicea या एक संकर एस से जीन से बना मार्ग का उपयोग शुरू किया erythraea, एस. fradiae, और एस. venezuelae जो मध्यवर्ती इरिथ्रोमाइसिन सी और 6-deoxyerythromycin डी, क्रमशः 20-22 का उत्पादन. हाल ही में, हमारे समूह erythrom उत्पादक द्वारा इन प्रयासों को बढ़ा दिया गया हैई. के माध्यम से ycin एक (इरिथ्रोमाइसिन के सबसे चिकित्सकीय प्रासंगिक रूप) कोलाई. पिछले काम के विपरीत, हमारी रणनीति coordinately 20 मूल एस व्यक्त erythraea जीन polyketide biosynthesis, deoxysugar biosynthesis और लगाव, अतिरिक्त सिलाई और आत्म प्रतिरोध (चित्रा 2) के लिए की जरूरत है. कुल में, 26 जीन (देशी और heterologous) ई. अनुमति देने के लिए इंजीनियर थे 4 मिलीग्राम / एल 23,24 पर एक इरिथ्रोमाइसिन उत्पादन कोलाई. इस परिणाम एक जटिल polyketide प्राकृतिक उत्पाद का पूरा उत्पादन स्थापित ई. का उपयोग कर कोलाई और इस नए उत्पादन विकल्प का लाभ उठाने या नए लोगों को आगे बढ़ाने के लिए एक आधार के रूप में कार्य करता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
2) biosynthetic पुनर्गठन, और 3) उत्पाद विश्लेषण) 1 आनुवंशिक हस्तांतरण: heterologous biosynthesis में महत्वपूर्ण कदम प्रक्रिया में तीन प्रक्रियात्मक बिंदुओं में से प्रत्येक पर सामना कर रहे हैं. किसी भी स्तर पर एक समस्या heterologous biosynthesis …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों biosynthesis heterologous के लिए समर्पित परियोजनाओं का समर्थन करने के लिए वित्त पोषण के लिए धन्यवाद (AI074224 और GM085323) NIH और NSF (0,712,019 और 0,924,699).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| PCR machine | Eppendorf | Mastercycler personal | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher | BP231 | |
| Electroporator | BioRad | Micropulser | |
| IPTG | Fisher | BP1620 | |
| Sodium propionate | Sigma | P1880 | |
| L-arabinose | Sigma | A3256 | |
| Refrigerated Shaker | Thermo Scientific | MaxQ 4000 | |
| Microfuge | Eppendorf | Centrifuge 5415D | |
| pGro7 | Takara | Chaperone Plasmid Set (3340) | |
| pET21, pET28, pCDF-Duet-1 | EMD Chemicals | 69742-3, 69864, 71340 | |
| LC-MS | Applied Biosystems | 3200 Q-Trap | |
| Ethyl acetate | Sigma | 270989 | |
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| Vacuum centrifuge | Eppendorf | Concentrator 5301 | |
| Rotary Evaporator | Buchi | R-200 |
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