Dissektion und Immunhistochemie von Larven, Puppen und Erwachsenenbildung<em> Drosophila</em> Netzhäute

Summary

Die<em> Drosophila</em> Netzhaut ist eine kristallartige Gitter aus einer kleinen Anzahl von Zelltypen, die in einer stereotypen Art und Weise erzeugt werden zusammengesetzt¹. Seine Eignung für anspruchsvolle genetische Analyse ermöglicht die Untersuchung von komplexen Entwicklungs-Programme. Dieses Protokoll beschreibt Dissektionen und Immunhistochemie von Netzhaut an drei diskrete Entwicklungsstufen, mit einem Fokus auf Photorezeptor Differenzierung.

Abstract

Das Facettenauge von Drosophila melanogaster besteht aus etwa 750 Ommatidien (Einheit Augen). Jeder Ommatidium wird von etwa 20 Zellen, einschließlich Objektiv-sezernierenden Zapfenzellen, Pigmentzellen, einer Borste Zelle und acht Photorezeptoren (PRs) R1-R8 ² zusammen. Die PRs spezialisiert haben microvillar Strukturen, die Rhabdomeren, die lichtempfindliche Pigmente, die Rhodopsine (RHS) enthalten. Die Rhabdomere sechs PRs (R1-R6) ein Trapez bilden und enthalten Rh1 ^{3 4.} Die Rhabdomere von R7 und R8 im Tandem in die Mitte des Trapezes positioniert und den gleichen Weg des Lichtes. R7 und R8 PRs stochastisch exprimieren verschiedene Kombinationen von Rhs in zwei Subtypen ^5: Im 'p' Subtyp, Rh3 in p R7s mit RH5 in p R8S gekoppelt ist, während in der 'y' Subtyp, Rh4 in y R7s zugeordnet ist Rh6 in y R8S ^{6 7 8.}

Frühe Angabe PRs und Entwicklung Ommatidien beginnt in der larvalen Auge antennalen Imaginalscheibe eine Monoschicht von Epithelzellen. Eine Welle der Differenzierung fegt über die Scheibe ⁹ und initiiert den Aufbau von undifferenzierten Zellen in Ommatidien ^10-11. Die Gründer Zelle R8 wird in erster angegebenen rekrutiert R1-6 und dann R7 ^12-14. Anschließend, während Puppenentwicklung führt PR Differenzierung umfangreiche morphologische Veränderungen ^15, einschließlich rhabdomere Bildung, Synaptogenese und schließlich rh Ausdruck.

In diesem Protokoll beschreiben wir Methoden zur Netzhaut Dissektionen und Immunhistochemie an drei definierten Zeiträume der Netzhaut Entwicklung, die Anwendung auf eine Vielzahl von Fragen Netzhaut Bildung und Entwicklungswege angesprochen werden können. Hier verwenden wir diese Methoden, um die schrittweise PR Differenzierung am Ebene einzelner Zellen in whole mount Larven, midpupal und erwachsenen Netzhaut visualisieren ( <sTrong> Abbildung 1).

Protocol

Ein. Einführung In diesem Video beschreiben wir Methoden zur Netzhaut Dissektionen und Immunhistochemie an drei definierten Entwicklungszeiten: die dritte Larvenstadium Larvenstadium, das midpupal und die erwachsenen Stadium. Obwohl unser Protokoll auch für andere Puppen Stufen (für Details auf die früheren Stadien, siehe 16), wählten wir die midpupal Bühne, wie es optimal für die Bildgebung ist alles PRs in einer Brennebene und ihre Kerne sind leicht zu identifizieren, die e…

Discussion

Ein. Fehlerbehebung

Nach unserer Erfahrung erfordern Dissektionen Praxis (bis zu mehreren Wochen) und werden durch das Erreichen eine bequeme Handhaltung ²¹ durch ruhen die Ellenbogen und Unterarme auf den Tisch und mit den Fingern in Kontakt mit der Dissektion Gericht erleichtert. Auf diese Weise wird nur der Daumen, Zeigefinger und Mittelfinger durchführen subtilen Bewegungen.

Entfernen der Lamina ohne Beschädigung der Photorezeptoren ist wahrscheinli…

Materials

			Reagent
Phosphate-buffered saline (PBS1x, pH 7.4)	Sigma		Prepare 10x stock solution 20. Dilute with distilled water to obtain 1x PBS and store at room temperature. Cool on ice before dissections.
Triton-X 100	Sigma	9002-93-1	Caution: Irritant! Wear gloves. Prepare 50 ml 1xPBS with 0.3% Triton X-100 (PBST). Store at room temperature.
37% formaldehyde solution	Fisher Scientific	F75P1GAL	Caution: Toxic, probable human carcinogen! Wear gloves. Before the fixation step, freshly prepare 3.7% solution in a chemical fume hood by diluting with PBS, store on ice.
5% normal horse serum	Jackson Immuno Research	008-000-001	Prepare 5% v/v dilution in PBST. Store at four degrees.
Primary and secondary antibodies (e.g. Donkey anti-sheep Alexa Fluor 488, Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 555, Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647)	Invitrogen Molecular Probes	A11015 A31572 A31571	Dilute secondary antibodies 1:800 in PBST and store at four degrees.
Alexa Fluor 488 Phalloidin		A12379	Dilute 1:100 in secondary antibody solution.
Slowfade Gold Antifade reagent	Invitrogen Molecular Probes	S36936	Mounting medium. Store at -20 degrees.
Glycerol	Fisher Scientific	G31-1	For mounting. Prepare 10 ml of 50% dilution with distilled water, store at room temp.
CO2			For anesthetizing adult flies.
			Equipment
Two sharp forceps (Dumont #55)	Fine Science Tools	11255-20
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning		Prepare Sylgard dissection dish by filling a plastic Petri dish with Sylgard mixture.
Three-well glass dissection dishes	Fisher Scientific	21-379
Two minutien dissecting pins (0.1 mm diameter) and two pinholders (12 cm)	Fine Science tools	26002-10	Insert one minutien pin in each of the two pinholders and bend one of the pins to form a hook.
Microscope cover slips (22×22-1 and 24×40-1)	Fisher Scientific	12-542A
Microscope slides (25x75x1.0 mm; precleaned)	Fisher Scientific	12-550-143
1.5 ml microcentrifuge tubes
Clear nail polish or Scotch tape
Orbital shaker	Bellco
Slide holder box	Fisher Scientific
Parafilm	Bemis	PM996
Thin paintbrush
P20 and P200 micropipettes and tips
Dissecting microscope
Small bucket with ice			For cooling the glass well plates, dissected retinas and solutions.