Bepaling van de gas-fase zuurgraden van oligopeptiden
Summary
De bepaling van de gasfase zuursterkte van cysteine-bevattende oligopeptiden beschreven. De experimenten zijn uitgevoerd met een drievoudige quadrupool massaspectrometer. De relatieve zuurgraden van de peptiden worden gemeten met behulp van botsingsgeïnduceerde dissociatie experimenten, en de kwantitatieve zuurgraden worden bepaald met behulp van de uitgebreide Koks kinetische methode.
Abstract
Aminozuurresiduen op verschillende posities in gevouwen eiwitten vertonen vaak verschillende graden van zuurgraden. Bijvoorbeeld, een cysteïneresidu bij of nabij de N-terminus van een helix vaak zuurder dan die bij of nabij de C-terminus 1-6. Hoewel uitgebreid experimenteel onderzoek van de zuur-base eigenschappen van peptiden in de gecondenseerde fase, met name in waterige oplossingen 6-8 werden uitgevoerd, worden de resultaten vaak gecompliceerd door solventeffecten 7. De meeste van de actieve plaatsen in proteïnen zijn gelegen nabij het inwendige gebied waar solventeffecten zijn geminimaliseerd 9,10. Om intrinsieke zuur-base eigenschappen van peptiden en eiwitten te begrijpen, is het belangrijk om de studies uitgevoerd in een oplosmiddel-vrije omgeving.
We presenteren een methode om de zuurgraad van oligopeptiden meten in de gasfase. We maken gebruik van een cysteïne-bevattende oligopeptide, Ala 3 CysNH <sub> 2 (A 3 CH), als modelverbinding. De metingen zijn gebaseerd op de gevestigde uitgebreide Cooks kinetische methode (figuur 1) 11-16. De experimenten zijn uitgevoerd met een drievoudige quadrupool massaspectrometer gekoppeld aan een electrospray ionisatie (ESI) ionenbron (figuur 2). Voor elk peptide monster, worden verscheidene verwijzing zuren geselecteerd. De referentie-zuren zijn structureel vergelijkbaar organische verbindingen met bekende gasfase zuurgraden. Een oplossing van het mengsel van het peptide en een referentie-zuur wordt ingebracht in de massa spectrometer en een gasfase proton gebonden anionische cluster peptidehars referentie zuur wordt gevormd. De proton-gebonden cluster is massa geïsoleerd en vervolgens versnipperd via botsingsgeïnduceerde dissociatie (CID) experimenten. Het resulterende fragment ion abondantie worden geanalyseerd met behulp van een relatie tussen de zuurgraad en de cluster ion dissociatiekinetiek. De gasfase zuurgraad van het peptide dan obtained door lineaire regressie van de thermo-kinetische plots 17,18.
De werkwijze kan worden toegepast op een verscheidenheid van moleculaire systemen, waaronder organische verbindingen, aminozuren en derivaten daarvan, oligonucleotiden en oligopeptiden. Bij vergelijking van de gasfase zuursterkte experimenteel gemeten met de berekende waarden voor verschillende conformeren, kunnen conformationele effecten op de zuursterkte geëvalueerd.
Introduction
De zuurgraad van aminozuurresten van de belangrijkste eigenschappen die de thermochemische structuren beïnvloeden de reactiviteit en de vouwen ontvouwen van proteïnen 9,19. Individuele aminozuren vertonen vaak verschillende effectieve zuurgraden afhankelijk van hun locaties in eiwitten. In het bijzonder de residuen bij de actieve plaatsen vertonen vaak aanzienlijk verstoord zuurgraden. Een voorbeeld hiervan is de cysteïnerest die in de actieve plaatsen van het thioredoxine super-familie van enzymen 20,21. De actieve plaats cysteine ongewoon zuur vergeleken met die in ongevouwen eiwitten 3-5. Er is gesuggereerd dat de schroeflijnvormige conformatie een belangrijke bijdrage aan de ongebruikelijke zuurgraad kan hebben. Er zijn uitgebreide experimentele studies op het zuur-base eigenschappen van peptiden in oplossingen uitgevoerd, vooral in waterige oplossingen 2,6-8. De resultaten werden vaak gecompliceerd door oplosmiddeleffecten7. De meeste van de actieve plaatsen in proteïnen zijn gelegen nabij het inwendige gebied waar oplosmiddel effecten worden geminimaliseerd 9,10.
Om intrinsieke zuur-base eigenschappen van peptiden en eiwitten te begrijpen, is het belangrijk om de studies uitvoeren in een oplosmiddel-vrije omgeving. Hier introduceren we een massaspectrometrie-methode voor de bepaling van de gasfase zuurgraad. De benadering wordt aangeduid als de uitgebreide kookt kinetische methode. Deze werkwijze is met succes toegepast op een brede waaier van chemische systemen voor de bepaling van verschillende thermochemische eigenschappen, zoals de gasfase zuurgraad, de proton affiniteit, het metaalion affiniteit, de elektronenaffiniteit en de ionisatie-energie 11-15, 22-26. We hebben deze methode om de gasfase zuursterkte van een reeks oligo cysteïne-cysteïne-polyalanine en polyglycine peptiden 17,18,27 criteria gelden. Deze studies tonen aan dat het N-terminale cysteïne peptides beduidend zuurder dan de overeenkomstige C-eindstandige opties. De hoge zuurgraad van de eerste zijn waarschijnlijk te wijten aan de schroeflijnvormige conformationele effecten waarin het thiolaatanion sterk gestabiliseerd door de interactie met de macro-helix dipool. Wegens de niet-vluchtig en thermisch labiele aard van peptiden, de kinetische methode is de meest praktische benadering momenteel beschikbaar om redelijk juiste zuur-base thermochemische hoeveelheden peptiden 28 produceren.
De opzet en de vergelijking verband met de kinetische werkwijze zijn weergegeven in Figuur 1. De bepaling van de gasfase zuurgraad van peptide (AH) begint met de vorming van een reeks proton gebonden cluster anionen [A • H • A i] ¯ (of [ï • H • A + i ¯] ¯), in de ionenbron gebied van de massa spectrometer, waarbij A en A i ¯ ¯ de gedeprotoneerde vorm van de peptide ende referentie zuren respectievelijk. De referentie-zuren zijn organische verbindingen met bekende gasfase zuurgraden. De referentie zuren moeten structuren op elkaar (maar niet noodzakelijk gelijk aan die van het peptide). De gelijkenis van de structuur tussen referentie zuren waarborgt de overeenstemming van de entropie van deprotonering onder hen. De proton-gebonden cluster anionen massa geselecteerd en geactiveerd door botsingen en vervolgens gedissocieerd met behulp van botsing geïnduceerde dissociatie (CID) experimenten de overeenkomstige monomere anionen leveren, A en A i ¯ ¯ met snelheidsconstanten van k en k i, respectievelijk getoond in figuur 1a. Als secundaire breukpatroon verwaarloosbaar, de isotopenverhouding van de CID fragment ionen [ï] / [A i ¯], vormt een maat voor de verhouding van de snelheidsconstanten k / k i approximate. In de veronderstelling dat er geen omgekeerde activation belemmeringen voor zowel dissociatie kanalen, het CID product ion vertakking verhoudingen ln [ï] / [A ¯ i], wordt lineair gecorreleerd aan de gasfase zuurgraad van het peptide (Δ acid H) en die van de referentie-zuren (Δ acid H i), zoals getoond in figuur 1b. In deze vergelijking, Δ zuur H avg is de gemiddelde gasfase zuurgraad van de referentie-zuren, Δ (Δ S) is de entropie term (die constant worden aangenomen wanneer de referentie zuren structureel op elkaar lijken), R is universele gasconstante en T eff is de effectieve temperatuur van het systeem. De effectieve temperatuur is een empirische parameter die afhankelijk is van verschillende experimentele variabelen, waaronder de botsingsenergie.
De waarde van de gasfase zuurgraad wordt bepaald door het construeren van twee sets van thermo-kinetische plots. De eerste set is obvervat door het uitzetten van ln ([ï] / [A i ¯]) tegen Δ acid H i – Δ zuur H avg, zie figuur 4a. Lineaire regressie zal een reeks van rechte lijnen opleveren met de hellingen van X = 1 / RT eff en slim van Y = – [Δ zuur H – Δ zuur H avg] / RT eff – Δ (Δ S) / R. De tweede set curves verkregen door uitzetten van de verkregen slim (Y) van de eerste set op het overeenkomstige helling (X), zoals getoond in figuur 4b. Lineaire regressie produceert een nieuwe lijn met een helling van Δ zuur H – Δ zuur H avg en een intercept van Δ (Δ S) / R. De waarde van Δ H zuur wordt dan verkregen uit de helling en de entropie term, Δ (Δ S), verkregen uithet onderscheppen.
De experimenten zijn uitgevoerd met een drievoudige quadrupool massaspectrometer gekoppeld aan een electrospray ionisatie (ESI) ionenbron. Een schematisch diagram van de massaspectrometer wordt getoond in figuur 2. De CID experimenten worden uitgevoerd door de massa proton gebonden cluster anionen met de eerste quadrupool toestel selecteren en waardoor ze botsingen ondergaan met argon atomen gelekt in de botsing kamer die wordt gehouden op een druk van ongeveer 0,5 mTorr. De dissociatie product ionen worden massa geanalyseerd met de derde quadrupool eenheid. De CID spectra zijn opgenomen met meerdere botsing energieën met de m / z assortiment breed genoeg om alle mogelijke secundaire fragmenten te dekken. Het CID product ionenintensiteiten worden gemeten door het instrument in het gekozen reactie monitoring (SRM) modus waarin de scan is gericht op geselecteerde product ionen. De CID experimenten worden uitgevoerd op vier verschillende botsingsenergieën, overeenkomend metcentrum-van-massa energieën (E cm) van 1.0, 1.5, 2.0, en 2.5 eV, respectievelijk. Het midden-of-massa energie wordt berekend met de vergelijking: E = E cm lab [m / (M + m)], waarbij E lab de botsingsenergie in het laboratorium frame, m de massa van argon, en M de massa van het proton gebonden cluster ion.
In dit artikel gebruiken we de oligopeptide Ala 3 CysNH 2 (A 3 CH) als het model compound. De C-terminus is geamideerd en de thiolgroep (SH) van het cysteïneresidu de zure site. De keuze van een geschikte referentie-zuren is essentieel voor een succesvolle meting van de gasfase zuurgraad. De ideale referentie zuren zijn structureel vergelijkbaar (op elkaar) organische verbindingen met gevestigde gasfase zuurgraad waarden. De referentie zuren moet zuurgraad waarden dicht bij die van de peptiden. Voor het peptide A 3 CH, zes gehalogeneerde carboxylic zuren worden gekozen als referentie zuren. De zes referentie zuren zijn chloorazijnzuur (MCAH) broomazijnzuur (Mbah), difluoroacetic acid (DFAH), dichloorazijnzuur (DCAH), dibromoacetic acid (DBAH) en trifluorazijnzuur (TFAH). Twee ervan zullen DFAH en Mbah, worden gebruikt om het protocol illustreren.
Protocol
Representative Results
Discussion
De succesvolle meting van de gasfase zuurgraad van een peptide grotendeels op de selectie van geschikte referentie zuren. De ideale referentie zuren zijn structureel vergelijkbaar organische verbindingen met gevestigde gasfase zuurgraad waarden. De referentie zuren moet soortgelijke structuren op elkaar. Dit zal zorgen voor een soortgelijk entropie van deprotonering voor elk van de referentie-zuren in de set. De referentie zuren moet zuurgraad waarden dicht bij die van de peptiden. Voor kortere cysteïne-bevattende pept…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Mass Spectrometer | Varian | 1200 L and 320 L | |
| Chloroacetic acid | Sigma-Aldrich | 402923 | |
| Bromoacetic acid | Sigma-Aldrich | B56307 | |
| Difluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 142859 | |
| Dichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | D54702 | |
| Dibromoacetic acid | Sigma-Aldrich | 242357 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 |
References
- Forsyth, W. R., Antosiewicz, J. M., Robertson, A. D. Empirical relationships between protein structure and carboxyl pKa values in proteins. Proteins: Struct. Funct. Genet. 48 (2), 388-403 (2002).
- Huyghues-Despointes, B. M. P., Scholtz, J. M., Baldwin, R. L. Effect of a single aspartate on helix stability at different positions in a neutral alanine-based peptide. Protein Sci. 2 (10), 1604-1611 (1993).
- Takahashi, N., Creighton, T. E. On the Reactivity and Ionization of the Active Site Cysteine Residues of Escherichia coli Thioredoxin. Biochimie. 35 (25), 8342-8353 (1996).
- Gan, Z. R., Sardana, M. K., Jacobs, J. W., Polokoff, M. A. Yeast thioltransferase – the active site cysteines display differential reactivity. Archives of Biochemistry and Biophysics. 282 (1), 110-115 (1990).
- Philipps, B., Glockshuber, R. Randomization of the Entire Active-site Helix alpha 1 of the Thiol-disulfide Oxidoreductase DsbA from Escherichia coli. J. Biol. Chem. 277 (45), 43050-43057 (2002).
- Joshi, H. V., Meier, M. S. The effect of a peptide helix macrodipole on the pKa of an Asp side chain carboxylate. J. Am. Chem. Soc. 118, 12038-12044 (1996).
- Kortemme, T., Creighton, T. E. Ionization of cysteine residues at the termini of model α-helical peptides. Relevance to unusual thiol pKa values in proteins of the thioredoxin family. J. Mol. Biol. 253 (5), 799-812 (1995).
- Gallo, E. A., Gellman, S. H. Effect of a C-Terminal Cationic Group on the Competition between α-Helical Turn and β-Turn in a Model Depsipeptide. J. Am. Chem. Soc. 116 (25), 11560-11561 (1994).
- Honig, B., Nicholls, A. Classical electrostatics in biology and chemistry. Science. 268 (5214), 1144-1149 (1995).
- Warshel, A. Electrostatic basis of structure-function correlation in proteins. Acc. Chem. Res. 14 (9), 284-290 (1981).
- Cooks, R. G., Patrick, J. S., Kotiaho, T., McLuckey, S. A. Thermochemical determinations by the kinetic method. Mass Spectrom. Rev. 13 (4), 287-339 (1994).
- Cooks, R. G., Koskinen, J. T., Thomas, P. D. The kinetic method of making thermochemical determinations. J. Mass Spectrom. 34 (2), 85-92 (1999).
- Cheng, X., Wu, Z., Fenselau, C. Collision Energy Dependence of Proton-Bound Dimer Dissociation: Entropy Effects, Proton Affinities, and Intramolecular Hydrogen-Bonding in Protonated Peptides. J. Am. Chem. Soc. 115 (11), 4844-4848 (1993).
- Cerda, B. A., Wesdemiotis, C. Li+, Na+, and K+ Binding to the DNA and RNA Nucleobases. Bond Energies and Attachment Sites from the Dissociation of Metal Ion-Bound Heterodimers. J. Am. Chem. Soc. 118 (47), 11884-11892 (1996).
- Cooks, R. G., Wong, P. S. H. Kinetic Method of Making Thermochemical Determinations: Advances and Applications. Acc. Chem. Res. 31 (7), 379-386 (1998).
- Armentrout, P. B. Entropy Measurements and the Kinetic Method: a Statistically Meaningful Approach. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 11 (5), 371-379 (2000).
- Ren, J., Tan, J. P., Harper, R. T. Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyalanine Peptides I: A3,4CSH and HSCA3,4. J. Phys. Chem. A. 113 (41), 10903-10912 (2009).
- Morishetti, K. K., Huang, B. D. S., Yates, J. M., Ren, J. Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyglycine Peptides: The Effect of the Cysteine Position. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 21 (4), 603-614 (2010).
- Fersht, A. . Structure and mechanism in protein science. , (1999).
- Martin, J. L. Thioredoxin-a fold for all reasons. Structure. 3 (3), 245-250 (1995).
- Carvalho, A. P., Fernandes, P. A., Ramos, M. J. Similarities and Differences in the Thioredoxin Superfamily. Progress in Biophysics & Molecular Biology. 91 (3), 229-248 (2006).
- Bouchoux, G., Sablier, M., Berruyer-Penaud, F. Obtaining Thermochemical Data by the Extended Kinetic Method. J. Mass Spectrom. 39 (9), 986-997 (2004).
- Bouchoux, G., Desaphy, S., Bourcier, S., Malosse, C., Bimbong, R. N. B. Gas-Phase Protonation Thermochemistry of Arginine. J. Phys. Chem. B. 112 (11), 3410-3419 (2008).
- Bouchoux, G., Bimbong, R. N. B., Nacer, F. Gas-Phase Protonation Thermochemistry of Glutamic Acid. J. Phys. Chem. A. 113 (24), 6666-6676 (2009).
- Zheng, X., Cooks, R. G. Thermochemical Determinations by the Kinetic Method with Direct Entropy Correction. J. Phys. Chem. A. 106 (42), 9939-9946 (2002).
- Jones, C. M., Bernier, M., Carson, E., Colyer, K. E., Metz, R., Pawlow, A., Wischow, E. D., Webb, I., Andriole, E. J., Poutsma, J. C. Gas-phase acidities of the 20 protein amino acids. Int. J. Mass Spectrom. 267 (1-3), 54-62 (2007).
- Tan, J. P., Ren, J. Determination of the Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyalanine Peptides Using the Extended Kinetic Method. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18 (2), 188-194 (2007).
- Harrison, A. G. The gas-phase basicities and proton affinities of amino acids and peptides. Mass Spectrom. Rev. 16 (4), 201-217 (1997).
- Gutte, B. . Peptides: Synthesis, Structures, and Applications. , (1995).
- Barany, G., Merrifield, R. B. Solid-phase peptide synthesis. The Peptides. 2, 1-284 (1979).
- Chan, W. C., White, P. D. . Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. , (2000).
