Summary
Fastsættelsen af gas-fase syrer af cystein-holdige oligopeptider beskrives. Eksperimenterne udføres ved hjælp af en tripel kvadrupol massespektrometer. De relative syrer af peptiderne måles ved hjælp kollision-induceret dissociation eksperimenter, og de kvantitative syrer bestemmes ved hjælp af de udvidede Cooks kinetisk metode.
Abstract
Aminosyrerester placeret på forskellige positioner i foldede proteiner ofte udviser forskellige grader af syrer. For eksempel er en cysteinrest placeret ved eller nær N-terminalen af en helix ofte mere sure end ved eller nær C-terminalen 1-6. Selv omfattende eksperimentelle undersøgelser af syre-base egenskaber af peptider er blevet foretaget i den kondenserede fase, navnlig i vandige opløsninger 6-8, er resultaterne ofte kompliceret af solventeffekter 7. Faktisk er de fleste af de aktive steder i proteiner placeret nær den indre region, hvor opløsningsmiddel virkninger er blevet minimeret 9,10. For at forstå iboende syre-base egenskaber af peptider og proteiner, er det vigtigt at udføre undersøgelserne i et opløsningsmiddel-frit miljø.
Vi præsenterer en metode til at måle syrer af oligopeptider i gasfase. Vi bruger en cystein-holdige oligopeptid, Ala 3 CysNH <sub> 2 (A 3 CH), som modelforbindelse. Målingerne er baseret på veletablerede udvidet Cooks kinetisk metode (Figur 1) 11-16. Forsøgene udføres under anvendelse af en triple-kvadrupol massespektrometer interface med en elektrospray (ESI) ionkilde (figur 2). For hvert peptid stikprøve flere referencepunkter syrer valgt. Referenceværdierne syrer er strukturelt lignende organiske forbindelser med kendte gas-fase syrer. En opløsning af blandingen af peptidet og en reference syre indføres i massespektrometret, og en gas-fase proton-bundne anioniske klynge af peptid-henvisning Syren dannes. Proton-bundet cluster masse isoleres og efterfølgende fragmenteret via kollision-induceret dissociation (CID) eksperimenter. Det resulterende fragment ion mængderne er analyseret ved en relation mellem syrer og klyngen ion dissociation kinetik. Gasfase-surhedsgrad peptidet er derefter obtaiNed ved lineær regression af termo-kinetiske plots 17,18.
Fremgangsmåden kan anvendes til en bred vifte af molekylære systemer, herunder organiske forbindelser, aminosyrer og deres derivater, oligonukleotider og oligopeptider. Ved at sammenligne gas-fase syrer målt eksperimentelt med disse beregnede værdier for forskellige afarter kan konformationelle virkninger på syrer evalueres.
Introduction
De syrer af aminosyrerester er blandt de vigtigste termokemiske egenskaber, der påvirker strukturer, reaktivitet, og den folde-udfoldning processer af proteiner 9,19. Individuelle aminosyrerester ofte viser forskellige effektive syrer afhængigt af deres placeringer i proteiner. Ofte især resterne placeret på de aktive steder udviser signifikant forstyrret syrer. Et sådant eksempel er cysteinresten bosiddende i de aktive steder af thioredoxin super-familie af enzymer 20,21. Den aktive sted cystein er usædvanligt sure sammenlignet med dem i udfoldede proteiner 3-5. Det er blevet foreslået, at den spiralformede konformation kan have et væsentligt bidrag til den usædvanlige syreindhold. Der er omfattende eksperimentelle undersøgelser af syre-base egenskaber af peptider udføres i opløsninger, især i vandige opløsninger 2,6-8. Resultaterne blev ofte kompliceret af solventeffekter7.. Faktisk er de fleste af de aktive steder i proteiner placeret nær den indre område hvor solventeffekter minimeres 9,10.
For at forstå iboende syre-base egenskaber af peptider og proteiner, er det vigtigt at udføre undersøgelserne i et opløsningsmiddel-frit miljø. Her introducerer vi et massespektrometri-baseret metode til bestemmelse af den gas-fasen surhedsgrad. Den fremgangsmåde er benævnt udvidede Cooks kinetiske metode. Denne metode er blevet anvendt med succes til en bred vifte af kemiske systemer til bestemmelse af forskellige termokemiske egenskaber, såsom gas-fase syreindhold, proton affinitet, metalionen affinitet, elektron affinitet, og ioniseringsenergi 11-15, 22-26. Vi har anvendt denne metode til at bestemme gas-fase syrer af en serie af oligo cysteinholdige polyalanin og cystein-polyglycin peptider 17,18,27. Disse undersøgelser viser, at den N-terminale cystein peptides er betydeligt mere sure end de tilsvarende C-terminale dem. De høje syrer i det tidligere skyldes sandsynligvis de spiralformede konformationelle virkninger hvor thiolat anion kraftigt stabiliseret ved interaktion med helix makro-dipol. På grund af den ikke-flygtige og termisk labile karakter af peptider, er den kinetiske metode den mest praktiske fremgangsmåde til rådighed på nuværende tidspunkt at fremstille rimeligt nøjagtige syre-base termokemiske mængder af peptider 28.
Den generelle opbygning og ligningen forbundet med den kinetiske metode er vist i figur 1.. Bestemmelsen af gas-fasen surhedsgrad et peptid (AH) starter med dannelsen af en række proton-bundne klynge anioner, [A • H • A i] ¯ (eller [A ¯ • H + • Ai ¯] ¯), i ionkilden region i massespektrometret, hvor A ¯ og A i ¯ er deprotonerede former af peptidet ogreference syrer, hhv. Referenceværdierne syrer er organiske forbindelser med kendte gas-fase syrer. Referencetallene syrer skal have strukturer, der svarer til hinanden (men ikke nødvendigvis svarer til peptidet). Ligheden mellem strukturer mellem reference-syrer sikrer ligheden mellem de entropier af deprotonation blandt dem. Proton-bundne klynge anioner masse udvalgt og collisionally aktiveret og derefter dissocieret ved hjælp kollision-induceret dissociation (CID) eksperimenter til opnåelse af de tilsvarende monomere anioner, A ¯ og A i ¯, med hastighedskonstanterne for k og k I, henholdsvis, er vist i figur 1a. Hvis sekundære fragmenteringer er ubetydelige, den overflod forholdet mellem CID fragmentioner, [A ¯] / [A i ¯], udgør et omtrentligt mål for forholdet mellem ratekonstanter, k / k I. Under den antagelse, at der ikke er omvendt aktiveretion barrierer for både dissociation kanaler, CID produkt ion forgreningsforhold, ln [A ¯] / [A i. ¯], vil blive lineært korreleret til gasfase-surhed af peptid (Δ syre H) og de af reference-syrer (Δ syre H i), som vist i figur 1b. I denne ligning er Δ acid H avg den gennemsnitlige gas-fase surhedsgrad reference syrer, Δ (Δ S) er den entropi sigt (hvilket kan antages konstant, hvis reference syrer er strukturelt ligner hinanden), R er universel gas konstant, og T eff er den effektive temperatur af systemet. Den effektive temperatur er en empirisk parameter, der afhænger af flere eksperimentelle variabler, herunder kollisionen energi.
Værdien af gasfase-syreindhold bestemmes ved at konstruere to sæt termo-kinetiske plots. Det første sæt er obopretholdt ved at plotte ln ([A ¯] / [A i ¯]) mod Δ acid H i – Δ syre H avg, som vist i figur 4a. Lineær regression vil give et sæt af lige linjer med skråningerne af X = 1 / RT EFF og aflytninger af Y = – [Δ acid H – Δ acid H avg] / RT EFF – Δ (Δ S) / R. Det andet sæt af grunde opnås ved at plotte de resulterende opfanger (Y) fra det første sæt mod de tilsvarende skråninger (X), som vist i figur 4b. Lineær regression producerer en ny linje med en hældning på Δ acid H – Δ acid H avg og en skæring med Δ (Δ S) / R. Værdien af Δ acid H opnås derefter fra hældningen og entropi sigt Δ (Δ S), fås fraskæringspunktet.
Eksperimenterne udføres ved hjælp af en tripel kvadrupol massespektrometer grænseflader til en elektrospray (ESI) ionkilde. En skematisk diagram af massespektrometer er vist i figur 2.. De CID forsøg udføres efter masse at vælge proton-bundne klynge anioner med den første kvadrupol enheden og tillade dem at gennemgå kollisioner med argonatomer lækket ind kollisionen kammer, som holdes ved et tryk på omkring 0,5 mTorr. Dissociationen produkt ioner masse analyseres med den tredje quadrupol enheden. CID spektre optages på flere kollision energier med m / z interval bred nok til at dække alle mulige sekundære fragmenter. CID produkt ionintensiteter måles ved at sætte instrumentet i den valgte reaktion overvågning (SRM) tilstand, hvor scanningen er fokuseret på udvalgte produktområder ioner. CID eksperimenter udføres på fire forskellige kollision energier, svarende tilcenter-of-masse energi (E cm) på 1,0, 1,5, 2,0, og 2,5 eV, hhv. Centrum-of-masse energi beregnes ved ligning: E cm = E lab [m / (M + m)], hvor E lab er kollision energi i laboratoriet rammen, m er massen af argon og M er massen af proton-bundne klynge ion.
I denne artikel bruger vi oligopeptidet Ala 3 CysNH 2 (A 3 CH) som model compound. C-terminalen er amideret, og thiolgruppe (SH) i cysteinresten vil være den sure side. Udvælgelsen af egnede referenceprodukter syrer er afgørende for en vellykket måling af gas-fasen surhedsgrad. Den ideelle reference-syrer er strukturelt ligner (på hinanden) organiske forbindelser med veletablerede gasfaseeksperimenter surhedsgrad værdier. Referenceværdierne syrer skal have surhedsgrad værdier tæt på at af peptider. For peptid A 3 CH, halogenerede seks carboxylic syrer er valgt som reference syrer. De seks referencepunkter syrer er chloreddikesyre (MCAH), bromeddikesyre (MBAH), difluoreddikesyre (DFAH), dichloreddikesyre (DCAH), dibromoacetic syre (DBAH), og trifluoreddikesyre (TFAH). To af dem, vil DFAH og MBAH, anvendes til at illustrere protokollen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den vellykkede måling af gas-fase surhedsgrad af et peptid i høj grad baseret på udvælgelsen af egnede referencepunkter syrer. Den ideelle reference-syrer er strukturelt lignende organiske forbindelser med veletablerede gasfaseeksperimenter surhedsgrad værdier. Referencetallene syrer bør have lignende strukturer til hinanden. Dette vil sikre en tilsvarende entropi deprotonering for hver referenceopløsning syrer i sættet. Referenceværdierne syrer skal have surhedsgrad værdier tæt på de af peptider. For …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Mass Spectrometer | Varian | 1200 L and 320 L | |
| Chloroacetic acid | Sigma-Aldrich | 402923 | |
| Bromoacetic acid | Sigma-Aldrich | B56307 | |
| Difluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 142859 | |
| Dichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | D54702 | |
| Dibromoacetic acid | Sigma-Aldrich | 242357 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 |
References
- Forsyth, W. R., Antosiewicz, J. M., Robertson, A. D. Empirical relationships between protein structure and carboxyl pKa values in proteins. Proteins: Struct. Funct. Genet. 48 (2), 388-403 (2002).
- Huyghues-Despointes, B. M. P., Scholtz, J. M., Baldwin, R. L. Effect of a single aspartate on helix stability at different positions in a neutral alanine-based peptide. Protein Sci. 2 (10), 1604-1611 (1993).
- Takahashi, N., Creighton, T. E. On the Reactivity and Ionization of the Active Site Cysteine Residues of Escherichia coli Thioredoxin. Biochimie. 35 (25), 8342-8353 (1996).
- Gan, Z. R., Sardana, M. K., Jacobs, J. W., Polokoff, M. A. Yeast thioltransferase – the active site cysteines display differential reactivity. Archives of Biochemistry and Biophysics. 282 (1), 110-115 (1990).
- Philipps, B., Glockshuber, R. Randomization of the Entire Active-site Helix alpha 1 of the Thiol-disulfide Oxidoreductase DsbA from Escherichia coli. J. Biol. Chem. 277 (45), 43050-43057 (2002).
- Joshi, H. V., Meier, M. S. The effect of a peptide helix macrodipole on the pKa of an Asp side chain carboxylate. J. Am. Chem. Soc. 118, 12038-12044 (1996).
- Kortemme, T., Creighton, T. E. Ionization of cysteine residues at the termini of model α-helical peptides. Relevance to unusual thiol pKa values in proteins of the thioredoxin family. J. Mol. Biol. 253 (5), 799-812 (1995).
- Gallo, E. A., Gellman, S. H. Effect of a C-Terminal Cationic Group on the Competition between α-Helical Turn and β-Turn in a Model Depsipeptide. J. Am. Chem. Soc. 116 (25), 11560-11561 (1994).
- Honig, B., Nicholls, A. Classical electrostatics in biology and chemistry. Science. 268 (5214), 1144-1149 (1995).
- Warshel, A. Electrostatic basis of structure-function correlation in proteins. Acc. Chem. Res. 14 (9), 284-290 (1981).
- Cooks, R. G., Patrick, J. S., Kotiaho, T., McLuckey, S. A. Thermochemical determinations by the kinetic method. Mass Spectrom. Rev. 13 (4), 287-339 (1994).
- Cooks, R. G., Koskinen, J. T., Thomas, P. D. The kinetic method of making thermochemical determinations. J. Mass Spectrom. 34 (2), 85-92 (1999).
- Cheng, X., Wu, Z., Fenselau, C. Collision Energy Dependence of Proton-Bound Dimer Dissociation: Entropy Effects, Proton Affinities, and Intramolecular Hydrogen-Bonding in Protonated Peptides. J. Am. Chem. Soc. 115 (11), 4844-4848 (1993).
- Cerda, B. A., Wesdemiotis, C. Li+, Na+, and K+ Binding to the DNA and RNA Nucleobases. Bond Energies and Attachment Sites from the Dissociation of Metal Ion-Bound Heterodimers. J. Am. Chem. Soc. 118 (47), 11884-11892 (1996).
- Cooks, R. G., Wong, P. S. H. Kinetic Method of Making Thermochemical Determinations: Advances and Applications. Acc. Chem. Res. 31 (7), 379-386 (1998).
- Armentrout, P. B. Entropy Measurements and the Kinetic Method: a Statistically Meaningful Approach. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 11 (5), 371-379 (2000).
- Ren, J., Tan, J. P., Harper, R. T. Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyalanine Peptides I: A3,4CSH and HSCA3,4. J. Phys. Chem. A. 113 (41), 10903-10912 (2009).
- Morishetti, K. K., Huang, B. D. S., Yates, J. M., Ren, J. Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyglycine Peptides: The Effect of the Cysteine Position. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 21 (4), 603-614 (2010).
- Fersht, A. . Structure and mechanism in protein science. , (1999).
- Martin, J. L. Thioredoxin-a fold for all reasons. Structure. 3 (3), 245-250 (1995).
- Carvalho, A. P., Fernandes, P. A., Ramos, M. J. Similarities and Differences in the Thioredoxin Superfamily. Progress in Biophysics & Molecular Biology. 91 (3), 229-248 (2006).
- Bouchoux, G., Sablier, M., Berruyer-Penaud, F. Obtaining Thermochemical Data by the Extended Kinetic Method. J. Mass Spectrom. 39 (9), 986-997 (2004).
- Bouchoux, G., Desaphy, S., Bourcier, S., Malosse, C., Bimbong, R. N. B. Gas-Phase Protonation Thermochemistry of Arginine. J. Phys. Chem. B. 112 (11), 3410-3419 (2008).
- Bouchoux, G., Bimbong, R. N. B., Nacer, F. Gas-Phase Protonation Thermochemistry of Glutamic Acid. J. Phys. Chem. A. 113 (24), 6666-6676 (2009).
- Zheng, X., Cooks, R. G. Thermochemical Determinations by the Kinetic Method with Direct Entropy Correction. J. Phys. Chem. A. 106 (42), 9939-9946 (2002).
- Jones, C. M., Bernier, M., Carson, E., Colyer, K. E., Metz, R., Pawlow, A., Wischow, E. D., Webb, I., Andriole, E. J., Poutsma, J. C. Gas-phase acidities of the 20 protein amino acids. Int. J. Mass Spectrom. 267 (1-3), 54-62 (2007).
- Tan, J. P., Ren, J. Determination of the Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyalanine Peptides Using the Extended Kinetic Method. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18 (2), 188-194 (2007).
- Harrison, A. G. The gas-phase basicities and proton affinities of amino acids and peptides. Mass Spectrom. Rev. 16 (4), 201-217 (1997).
- Gutte, B. . Peptides: Synthesis, Structures, and Applications. , (1995).
- Barany, G., Merrifield, R. B. Solid-phase peptide synthesis. The Peptides. 2, 1-284 (1979).
- Chan, W. C., White, P. D. . Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. , (2000).
