Laser-påført skade av Sebrafisk Embryonic skjelettmuskulatur

Summary

Fremgangsmåten presenteres her omfatter den nøyaktige skade av levende sebrafisk embryoer med høyenergi laserpulser og den påfølgende analyse av disse skadene og deres utvinning med tid. Vi viser også hvordan genetisk merket single eller grupper av skjelett muskelceller kan spores under og etter laserlys indusert skade.

Abstract

Ulike eksperimentelle tilnærminger har vært brukt i mus for å indusere muskelskade med sikte på å studere muskelregenerasjonenen, inkludert myotoxin injeksjoner (bupivacaine, Cardiotoxin eller notexin), muskel transplantasjoner (denervering-devascularization indusert gjenfødelse), intensiv trening, men også murine muskeldystrofi modeller eksempel MDX mus (for en gjennomgang av disse tilnærmingene se ^1). I sebrafisk, genetiske metoder inkluderer mutanter som viser muskeldystrofi fenotyper (som runzel ² eller sapje ³⁾ og antisens oligonukleotid morpholinos som blokkerer uttrykk for dystrofi-tilknyttede gener ^4. Dessuten, kjemiske tilnærminger er også mulig, for eksempel med Galanthamine, en kjemisk forbindelse inhibere acetylkolinesterase, og dermed resulterer i hypercontraction, som til slutt fører til muskeldystrofi ^5. Men genetiske og farmakologiske tilnærminger generally påvirke alle musklene i et individ, mens omfanget av fysisk påført skader er lettere kontrolleres romlig og tidsmessig ^en. Lokalisert fysiske skader gjør at vurderingen av kontralaterale muskel som en intern kontroll. Faktisk har vi nylig brukte laser-mediert celle ablasjon å studere skjelettmuskelen regenerering i sebrafisk embryo ^6, mens en annen gruppe nylig rapportert bruk av en to-foton laser (822 nm) til å skade meget lokalt plasmamembranen av individuelle embryonale sebrafisk muskel celler ^7.

Her rapporterer vi en metode for å bruke micropoint laser (Andor Technology) for muskel-skjelettlidelser celle skade i sebrafisk embryo. Den micropoint laser er en høy energi laser som er egnet for målrettet celle ablasjon ved en bølgelengde på 435 nm. Laseren er koblet til et mikroskop (i vårt oppsett, et optisk mikroskop fra Zeiss) på en slik måte at mikroskopet kan brukes samtidig feller fokusere laserlys på prøven og for å visualisere effekten av sårene (lysfelt eller fluorescens). Parametrene for kontrollere laserpulser inkluderer bølgelengde, intensitet og antall pulser.

På grunn av sin åpenhet og eksterne embryoutvikling, er sebrafisk embryo svært mottagelig for både laser-indusert skade og for å studere den påfølgende utvinning. Mellom 1 og 2 dager etter befruktning, somitic skjelettmuskel celler progressivt gjennomgå modning fra anteriort for posteriore grunnet utviklingen av somitogenesen fra stammen til de ^{8 halen, 9.} På disse trinnene, embryo spontant rykk og initiere svømming. Sebrafisk har nylig blitt anerkjent som en viktig virveldyr modell organisme for studiet av vev gjenfødelse, som mange typer vev (hjerte, neuronal, vaskulær etc.) kan regenereres etter skade i voksen ^{10 sebrafisk, 11.}

Protocol

1. Merking enkeltceller Injisere en-celle stadiet embryoer med et plasmid som koder GFP eller GFP-fusjonsprotein under kontroll av en β-Actin promotor. Under utviklingen er GFP deretter uttrykt i en mosaikk mote. Her, vi brukte transgene konstruktet Tg [β-aktin: α-actinin-GFP], som plasserer α-Actinin-GFP fusjonsprotein under kontroll av β-aktin promoter. 2. Embryo Embedding Samle sebrafisk embryoer og vedlikeholde u…

Representative Results

Laser-mediert skade ble utført på immobilisert en dag gamle embryoer. Som vist i figur 1, kan et par laserpulser generere et lite sår, lett gjenkjennelig ved de skadede, kveilet, Actin-rike myofibrils som normalt strukket mellom somitt grenser. Et høyere antall laser pulser vil imidlertid føre til et massivt skadet somitt blokk, der de fleste myofibrils er ødelagt. Likevel kan vi bokstavelig talt observere at "tiden leger alle sår", med små skader healing raskere enn større. Etter gje…

Discussion

Laser-mediert skade er en kraftig metode for å påføre sår ønsket størrelse ved ablating celler for å studere regenerering under kontrollerte forhold i sebrafisk embryo. Spesielt, kan cellene være målrettet presist (figur 2), og begge skaden området samt timing kan kontrolleres. Deretter blir skaden nettstedet og fornyelsesprosesser lett overvåkes, fart (fig. 3) og analyseres (figur 1). Imidlertid, selv om laseren er godt fokusert i x-og y-aksen, er det ikke f…

Materials

Heating block
Pair #5 forceps	Dumont
Glass slides	Menzel		76 x 26 mm
Coverslips	Roth		50 x 24 mm #1
Petroleum jelly
Stereomicroscope	Leica		MZFLIII
Micropoint laser	Andor Technology
Fluorescence microscope	Zeiss		Axioplan II
Metamorph software	Molecular devices
			Reagents Low-melting point agarose ( #50081, Lonza) Tricaine stock solution: 400 mg Tricaine (#A-5040, Sigma-Aldrich ) / 100 ml dH2O pH 9.0 E3 medium (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4)