Zebrafish 배아 골격근의 레이저 쏜 부상
Summary
여기에 제시된 방법은 고 에너지 레이저 펄스와 시간을 통해 이러한 부상과 회복의 후속 분석 라이브 zebrafish 배아의 정확한 부상을 포함한다. 우리는 또한 유전자 하나의 표시 또는 골격근 세포의 그룹이 동안 레이저 광 유도 손상 후 추적 할 수있는 방법을 보여줍니다.
Abstract
다양한 실험 방법은 손쥐 근육 영양 장애 모델도 myotoxin 주사 (bupivacaine, cardiotoxin 또는 notexin), 근육 transplantations (denervation-devascularization 유도 재생), 집중적 인 운동을 포함하여 근육 재생을 연구하는 목적으로 근육 부상을 유발하기 위해 마우스를 사용하지만, 한 MDX 마우스 (이 방법의 검토 1 참조) 등. zebrafish에서 유전자 접근법은 근육의 영양 장애의 phenotypes (예 : runzel 2 sapje 3 등) 전시 및 영양 장애 – 관련 유전자의 표현 4 차단 oligonucleotide morpholinos를 안티센스 돌연변이가 포함되어 있습니다. 또, 화학 접근함으로써 결국 근육 영양 장애 5 연결 hypercontraction, 그 결과도 Galanthamine, 화학 화합물 억제 acetylcholinesterase와 예 가능합니다. 그러나, 유전 및 약리 접근 g물리적으로 입은 부상의 정도가보다 쉽게 spatially과 시간적으로 한 통제하는 반면 enerally, 개인 내의 모든 근육에 영향을 미칩니다. 현지화 신체적 부상은 내부 통제 등의 contralateral 근육 평가를 할 수 있습니다. 다른 그룹은 최근 매우 로컬 개별 배아 zebrafish 근육의 플라즈마 막에 손상을하기 위해 두 광자 레이저 (822 nm 정도)의 사용을보고하면서 실제로, 우리는 최근 zebrafish 배아 6 골격근 재생을 공부하는 레이저로 인한 세포 절개를 사용 세포 7.
여기, 우리는 zebrafish 배아의 골격근 세포 손상에 대한 micropoint 레이저 (ANDOR 기술)를 사용하는 방법을보고합니다. micropoint 레이저는 435 nm의 파장을 대상으로 휴대 절제에 적합한 고 에너지 레이저입니다. 레이저는 현미경이 동일한 시간 F에서 사용할 수있는 방식으로 (우리의 설치, Zeiss의 광학 현미경)을 현미경에 연결되어또는 샘플에와 남긴 상처 (brightfield 또는 형광)의 효과를 시각화를위한 레이저 빛을 초점을 맞추고. 레이저 펄스를 제어하기위한 매개 변수 파장, 강도, 그리고 펄스의 수를 포함합니다.
의 투명성과 외부 배아 발달로 인해, zebrafish 배아는 레이저 유도 부상 및 모두 후속 복구를 공부 높은 의무가 있습니다. 1 ~ 2 일 후 수정을, somitic 골격근 세포는 점차적으로 꼬리 8, 9 트렁크에서 somitogenesis의 진행으로 인해 뒤쪽하기 위해 앞의 성숙을 받고있다. 이 단계에서 배아는 자발적으로 경련과 수영을 시작합니다. zebrafish는 최근 성인 zebrafish 10, 11 부상 후 다시 생성 할 수 있습니다 조직의 여러 유형 (등 혈관, neuronal, 심장)으로, 조직 재생 연구의 중요한 척추 모델 생물체로 인식되었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
레이저로 인한 손상은 zebrafish 배아의 제어 조건 하에서 재생을 연구하기 위해 셀을 흡열하여 원하는 크기의 상처를 가하는위한 강력한 방법입니다. 특히, 세포는 정확하게 타겟팅 할 수 있습니다 (그림 2)와 상해 지역뿐만 아니라 타이밍이 모두 제어 할 수 있습니다. 그 후, 부상 사이트 및 재생 프로세스는 쉽게, 모니터링 기록 (그림 3) 및 (그림 1) 분석됩니다…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 기술적 인 도움과 조언을 밥 Nowak (ANDOR 기술)을 감사드립니다. SA-S. 독일 Forschungsgemeinschaft (DFG)의 하이젠 베르크 친목에 의해 지원됩니다. 이 작품은 기금 SE2016/7-1을 DFG의 지원을했습니다.
Materials
| Heating block | |||
| Pair #5 forceps | Dumont | ||
| Glass slides | Menzel | 76 x 26 mm | |
| Coverslips | Roth | 50 x 24 mm #1 | |
| Petroleum jelly | |||
| Stereomicroscope | Leica | MZFLIII | |
| Micropoint laser | Andor Technology | ||
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axioplan II | |
| Metamorph software | Molecular devices | ||
Reagents
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References
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