Isolation, karakterisering og sammenlignende differentiering af humane Dental Pulp stamceller fra blivende tænder ved hjælp af to forskellige metoder

Summary

Fremgangsmåden beskrevet isolering og karakterisering af humane dental pulp stamceller (hDPSCs) ved anvendelse af enten<strong> Enzymatisk dissociation af papirmasse (dpsc-ED)</strong> Eller<strong> Direkte udvækst af stamceller fra pulpavæv eksplantater (dpsc-OG). Derefter fulgt af</strong><em> In vitro</em> Sammenlignende differentiering af begge typer hDPSCs i odontoblasts.

Abstract

<p class="jove_content"> Udvikling visdomstænder er let tilgængelig kilde til stamceller i voksenalderen, som kan opnås ved rutinemæssige ortodontisk behandling. Humane pulp-afledte stamceller (hDPSCs) besidder høj proliferation potentiale med multi-slægt differentiering kapacitet sammenlignet med den almindelige kilde til voksne stamceller^1-8, Og derfor kunne hDPSCs være gode kandidater til autolog transplantation i vævsteknologi og regenerativ medicin. Sammen med disse fordele, har de mesenkymale stamceller (MSC) funktioner, såsom immunolodulatory effekt gøre hDPSCs mere værdifuldt, selv i tilfælde af allotransplantation^6,9,10. Derfor er det primære trin til anvendelse af denne kilde til stamceller er at vælge den bedste protokol til isolering hDPSCs fra pulpavæv. For at nå dette mål, er det afgørende at undersøge effekten af ​​forskellige isolation forhold på forskellige cellulære adfærd, såsom deres fælles overflademarkører & også deres differentiering kapacitet.</p><p class="jove_content"> Således her adskiller vi menneskelig pulpavæv fra påvirket tredje kindtand tænder, og derefter bruges både eksisterende protokoller baseret på litteratur, til isolering hDPSCs,^11-13<em> Dvs</em> Enzymatisk dissociation af pulpavæv (dpsc-ED) eller udvækst fra væv eksplantater (dpsc-OG). I denne forbindelse forsøgte vi at lette isoleringsmetoder ved hjælp af dental diamant disk. Derefter disse celler karakteriseres i form af stromal-associerede markører (CD73, CD90, CD105 og CD44), hæmatopoietiske / endothelial markører (CD34, CD45 og CD11b), perivaskulær markør, såsom CD146 og også STRO-1. Derefter blev de to protokoller i forhold baseret på differentiering styrken i odontoblasts af både kvantitativ polymerase chain reaction (qPCR) og Alizarin Red-farvning. QPCR blev brugt til vurdering af ekspressionen af ​​mineralisering-relaterede gener (alkalisk phosphatase, ALP, matrix ekstracellulære phosphoglycoprotein, MEPE & dentin sialophosphoprotein, DSPP).<sup> 14</sup</p>

Introduction

Stamceller er klonogene celler, som besidder to bemærkelsesværdige features, kendt som multi-potens og selvfornyelse ^15. Blandt alle stamceller med forskellige replikative kræfter, har dental stamceller som de postnatale stamceller henledt opmærksomheden i de senere år på grund af deres tilgængelighed, plasticitet og høj proliferativ evne i sammenligning med andre voksne stamceller ^16. Karakteristisk lighed med de mesenkymale stamceller, dental pulp stamceller er adhærente klonogene celler, der har multiple differentiering kapacitet til mesenkym-og / eller ikke-mesenchym linier, både de vitro og in vivo. ^1-8,17,18 DPSCs identificeres ved deres negative udtryk for hæmatopoietiske antigener (f.eks CD45, CD34, CD14), og positivt udtryk for CD90, CD29, CD73, CD105, CD44 og STRO-1. ^19,20

Nem opnåede potentiale med mindst smerte & sygelighed stille menneskelige DPSCs som et værdifuldtstand kilde MSC'er sammenlignet med de almindelige kilder, såsom knoglemarv mesenchymstamceller ^21. Generelt er DPSCs blevet isoleret enten ved udvækst metode, dvs, migration af stamceller fra pulpavæv eksplantater (dpsc-OG) ^22-24 og / eller ved enzymatisk nedbrydning (dpsc-ED) ^4,6,25. Tidligere undersøgelser har vist, at isoleringsmetoden og dyrkningsbetingelser kan fremkalde forskellige populationer eller slægter under de vitro passager ^26,27. I tilfælde af blivende tænder (pDPSCs), afslørede Huang et al, at enzymatiske fordøjede pDPSCs har højere proliferation potentiale sammenlignet med de outgrown DPSCs. ²⁶ endvidere i tilfælde af løvfældende tænder (dDPSCs), blev det påvist, STRO-1 og CD34 markører udtrykt mere i dDPSC-ED sammenlignet med dDPSC-OG. Desuden viste dDPSC-ED højere mineraliseringsgrad i definerede osteo / odonto medium. ²⁷ På grund af den enestående potentiale DPSCs i regenerative medicin, vil flere ikke være påkrævet for bedre forståelse af mulige forskellige populationer som er afledt af forskellige isoleringsmetoder.

Her var forsøg på at indføre nem måde af papirmasse ekstraktion, ved hjælp af en-trins dental diamant disk for at lette processen med pulp ekstraktion. Endvidere, efter isolering af humane pulp-afledte stamceller ved at anvende ED eller OG metoder, blev generelle egenskaber og differentiering kapacitet mellem to grupper også undersøgt.

Protocol

1. Forbered enzymopløsningen og spredning Medium (PM) Gør Collagenase Type I Løsning: Afvej collagenase type I (12 mg / ml) og opløses i 1 ml PBS og filtreres under anvendelse af en 0,2 um sprøjtefilter. Derefter placere det 15 ml rør og holde det ved -20 ° C indtil brug. Gør dispase Løsning: Afvej dispase (16 mg / ml) og opløses i 1 ml PBS og filtreres under anvendelse af en 0,2 um sprøjtefilter. Derefter placere det 15 ml rør og holde det ved 4 ° C in…

Representative Results

DPSCs, der blev opnået ved enzymatisk dissociation (dpsc-ED) er vist her på dag 10, 15,18 (fig. 1). Kolonierne indledt til dannelse på næsten 3-5 dage efter isolering. Vokset DPSCs (dpsc-OG) er vist i figur 2 på dag 5, 10, 13 & 18. Fibroblastlignende celler begyndte at migrere fra pulpavæv til kolben ved parallelle bestilling med næsten 5 dage efter podning. DPSCs ved passage 3 ved hjælp af begge fremgangsmåder er vist i figur 3.. Begge typer DPSCs var …

Discussion

Denne protokol beskriver processen med isolering og karakterisering af hDPSCs fra dental pulp ved hjælp af to metoder, enzymatisk dissociation og direkte udvækst af stamceller fra pulpavæv eksplantater. Desuden, in vitro differentiering af disse celler i odontoblasts blev vurderet ved kvantitativ Alizarin Red S assay og qPCR.

Eksisterende protokoller til isolering pulpavæv fra human tand var blevet brugt forskellige instrumenter, såsom tang (knogle tang) 9, udryddelse nål <sup…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue or Lot. number	Comments (optional)
α-MEM	GIBCO	11900-073
Collagenase type I	Sigma-Aldrich	C0130-100MG
Dispase	GIBCO	17105-041
Penicillin/streptomycin	GIBCO	15140-122
Amphotericin B	GIBCO	15290-018
Fetal Bovine serum defined (FBS)	HyClone	SH30070.03
L-ascorbic acid 2-phosphate	Sigma	A8960-5G
L-glutamine	GIBCO	25030-024
Dexamethasone	Sigma	D4902
β-Glycerol phosphate disodium salt hydrate, BioUltra	Sigma	G9422-100G
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P5655
Osteogenesis Assay Kit	Millipore	PS01802031
Mouse IgG2b-PE isotype control	BD pharmingen	50808088029
FITC mouse IgG2b isotype control	BD pharmingen	559532
FITC mouse IgG1 κ isotype	BD pharmingen	11471471
FITC/PE mouse anti-human CD34/CD45	BD pharmingen	341071
PE anti-human CD146	BD pharmingen	550315
Monoclonal mouse anti-human CD90/FITC	Daka	00034418
PE mouse anti-human CD73	BD pharmingen	550257
Anti-h CD105/Endoglin PE	BD pharmingen	FAB10971P
PE mouse anti-human CD11b/Mac1	BD pharmingen	5553888
CD44 PE mouse anti human	BD pharmingen	555479
Phosphate buffer Solution (PBS)	GIBCO	003000
70-μm cell strainer	Falcon	352360
0.2 μm syringe filter	Millex-GV	SLGV033RB
25 cm2 culture flask	Sigma-Aldrich	Z707481
			EQUIPMENT
BD FACSCalibur	BD	342975
multiskan microplate spectrophotometer	Thermo scientific	51119200
Fleurcense Microscope	Olympus
Flowing Software version 2.3.1