Fremgangsmåden beskrevet isolering og karakterisering af humane dental pulp stamceller (hDPSCs) ved anvendelse af enten<strong> Enzymatisk dissociation af papirmasse (dpsc-ED)</strong> Eller<strong> Direkte udvækst af stamceller fra pulpavæv eksplantater (dpsc-OG). Derefter fulgt af</strong><em> In vitro</em> Sammenlignende differentiering af begge typer hDPSCs i odontoblasts.
Stamceller er klonogene celler, som besidder to bemærkelsesværdige features, kendt som multi-potens og selvfornyelse 15. Blandt alle stamceller med forskellige replikative kræfter, har dental stamceller som de postnatale stamceller henledt opmærksomheden i de senere år på grund af deres tilgængelighed, plasticitet og høj proliferativ evne i sammenligning med andre voksne stamceller 16. Karakteristisk lighed med de mesenkymale stamceller, dental pulp stamceller er adhærente klonogene celler, der har multiple differentiering kapacitet til mesenkym-og / eller ikke-mesenchym linier, både de vitro og in vivo. 1-8,17,18 DPSCs identificeres ved deres negative udtryk for hæmatopoietiske antigener (f.eks CD45, CD34, CD14), og positivt udtryk for CD90, CD29, CD73, CD105, CD44 og STRO-1. 19,20
Nem opnåede potentiale med mindst smerte & sygelighed stille menneskelige DPSCs som et værdifuldtstand kilde MSC'er sammenlignet med de almindelige kilder, såsom knoglemarv mesenchymstamceller 21. Generelt er DPSCs blevet isoleret enten ved udvækst metode, dvs, migration af stamceller fra pulpavæv eksplantater (dpsc-OG) 22-24 og / eller ved enzymatisk nedbrydning (dpsc-ED) 4,6,25. Tidligere undersøgelser har vist, at isoleringsmetoden og dyrkningsbetingelser kan fremkalde forskellige populationer eller slægter under de vitro passager 26,27. I tilfælde af blivende tænder (pDPSCs), afslørede Huang et al, at enzymatiske fordøjede pDPSCs har højere proliferation potentiale sammenlignet med de outgrown DPSCs. 26 endvidere i tilfælde af løvfældende tænder (dDPSCs), blev det påvist, STRO-1 og CD34 markører udtrykt mere i dDPSC-ED sammenlignet med dDPSC-OG. Desuden viste dDPSC-ED højere mineraliseringsgrad i definerede osteo / odonto medium. 27 På grund af den enestående potentiale DPSCs i regenerative medicin, vil flere ikke være påkrævet for bedre forståelse af mulige forskellige populationer som er afledt af forskellige isoleringsmetoder.
Her var forsøg på at indføre nem måde af papirmasse ekstraktion, ved hjælp af en-trins dental diamant disk for at lette processen med pulp ekstraktion. Endvidere, efter isolering af humane pulp-afledte stamceller ved at anvende ED eller OG metoder, blev generelle egenskaber og differentiering kapacitet mellem to grupper også undersøgt.
Denne protokol beskriver processen med isolering og karakterisering af hDPSCs fra dental pulp ved hjælp af to metoder, enzymatisk dissociation og direkte udvækst af stamceller fra pulpavæv eksplantater. Desuden, in vitro differentiering af disse celler i odontoblasts blev vurderet ved kvantitativ Alizarin Red S assay og qPCR.
Eksisterende protokoller til isolering pulpavæv fra human tand var blevet brugt forskellige instrumenter, såsom tang (knogle tang) 9, udryddelse nål <sup…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Leila Shakeri & Dr. Aref Dournaei for deres kritiske discus og Mr. Mohammad Reza Khadem Sharif for hans tekniske hjælpemidler.
Name of the reagent | Company | Catalogue or Lot. number | Comments (optional) |
α-MEM | GIBCO | 11900-073 | |
Collagenase type I | Sigma-Aldrich | C0130-100MG | |
Dispase | GIBCO | 17105-041 | |
Penicillin/streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
Amphotericin B | GIBCO | 15290-018 | |
Fetal Bovine serum defined (FBS) | HyClone | SH30070.03 | |
L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960-5G | |
L-glutamine | GIBCO | 25030-024 | |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
β-Glycerol phosphate disodium salt hydrate, BioUltra | Sigma | G9422-100G | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
Osteogenesis Assay Kit | Millipore | PS01802031 | |
Mouse IgG2b-PE isotype control | BD pharmingen | 50808088029 | |
FITC mouse IgG2b isotype control | BD pharmingen | 559532 | |
FITC mouse IgG1 κ isotype | BD pharmingen | 11471471 | |
FITC/PE mouse anti-human CD34/CD45 | BD pharmingen | 341071 | |
PE anti-human CD146 | BD pharmingen | 550315 | |
Monoclonal mouse anti-human CD90/FITC | Daka | 00034418 | |
PE mouse anti-human CD73 | BD pharmingen | 550257 | |
Anti-h CD105/Endoglin PE | BD pharmingen | FAB10971P | |
PE mouse anti-human CD11b/Mac1 | BD pharmingen | 5553888 | |
CD44 PE mouse anti human | BD pharmingen | 555479 | |
Phosphate buffer Solution (PBS) | GIBCO | 003000 | |
70-μm cell strainer | Falcon | 352360 | |
0.2 μm syringe filter | Millex-GV | SLGV033RB | |
25 cm2 culture flask | Sigma-Aldrich | Z707481 | |
EQUIPMENT | |||
BD FACSCalibur | BD | 342975 | |
multiskan microplate spectrophotometer | Thermo scientific | 51119200 | |
Fleurcense Microscope | Olympus | ||
Flowing Software version 2.3.1 |