JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Médecine

İnsan Diş Pulp Kök Hücre İzolasyonu, Karakterizasyonu ve Karşılaştırmalı Farklılaşma İki Farklı Yöntemler Kullanılarak Daimi Dişler türetilen

Published: November 24, 2012
doi:
10.3791/4372
, ,
1Department of Stem Cells and Developmental Biology, Cell Science Research Center,Royan Institute for Stem Cell Biology and Technology, ACECR, Tehran, Iran, 2Department of Endocrinology & Female Infertility, Reproductive Biomedicine Center,Royan Institute for Reproductive Biomedicine, ACECR, Tehran, Iran

Summary

Yöntemi kullanarak insan dental pulpa kök hücrelerinin (hDPSCs) izolasyonu ve karakterizasyonu tarif<strongKağıt hamuru> enzimatik ayrışma (DPSC-ED)</strong> Veya<strongpulpa dokusu eksplantları alınan kök hücrelerin> direkt sonucudur (DPSC-OG). Sonra takip</strong><em> In vitro</emOdontoblastlar> karşılaştırmalı farklılaşma.

Abstract

<p class="jove_content"> Gelişmekte yirmilik dişler rutin ortodontik tedaviler ile elde edilebilir yetişkinlik döneminde kök hücrelerin kolay erişilebilir bir kaynak vardır. İnsan hamuru kökenli kök hücreleri (hDPSCs) erişkin kök hücrelerin olağan kaynağı karşılaştırmak çok soy farklılaşma kapasitesine sahip yüksek proliferasyon potansiyeline sahip<sup> 1-8</sup>, Bu nedenle hDPSCs doku mühendisliği ve rejeneratif tıp otolog transplantasyon için iyi bir aday olabilir. Bu avantajları ile birlikte, bu tür immunolodulatory etki olarak mezenkimal kök hücreleri (MSC) özellikleri haiz, hatta allograft nakli durumunda, hDPSCs daha değerli yapmak<sup> 6,9,10</sup>. Bu nedenle, kök hücre kaynağı kullanmak için birincil adım pulpa dokusu hDPSCs yalıtmak için en iyi protokolü seçmektir. Bu amaca ulaşmak için, bu tür ortak yüzey belirteçleri ve ayrıca farklılaşma kapasitesi gibi farklı hücresel davranışlar, çeşitli izolasyon koşullarının etkisini incelemek için çok önemlidir.</p><p class="jove_content"> Böylece, burada gömülü üçüncü molar dişler insan pulpa dokusu ayırmak ve sonra tecrit hDPSCs için literatüre dayalı mevcut protokoller, hem de kullanılan<sup> 11-13</sup><em> Yani</emDoku> enzimatik pulpa dokusunun dissosiasyon (DPSC-ED) veya akıbet (DPSC-OG). Bu bağlamda, biz diş elmas disketi kullanarak izolasyon yöntemleri kolaylaştırmak için çalıştı. Sonra, bu hücreler CD146 ve ayrıca STRO-1 gibi stromal ilişkili Markers (CD73, CD90, CD105 ve CD44), hematopoetik / endotel Markers (CD34, CD45 ve CD11b), perivasküler marker açısından karakterize. Daha sonra, bu iki protokol kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (QPCR) ve alizarin kırmızısı boyama her iki tarafından odontoblastlar içine farklılaşma etki göre karşılaştırılmıştır. QPCR mineralizasyon ilişkili genlerin ekspresyonu (; ALP, matris ekstraselüler phosphoglycoprotein; MEPE ve dentin sialophosphoprotein; DSPP alkalen fosfataz) değerlendirilmesi için kullanılmıştır.<sup> 14</sup</p>

Introduction

Kök hücreler, çok kudret ve kendini yenileme 15 olarak bilinen iki önemli özellik, sahip clonogenic hücrelerdir. Farklı replikatif potenslerine Tüm kök hücreler arasında, postnatal kök hücreler olarak diş kök hücreleri nedeniyle erişilebilirlik, esneklik, ve diğer yetişkin kök hücreleri 16 ile karşılaştırıldığında yüksek proliferatif yeteneği son yıllarda dikkat çekmektedir. Karakteristik olarak, mezenkimal kök hücreler ile benzer şekilde, diş özü kök hücrelerinin farklılaşmasını çoklu mezenşim içine kapasitesi ve / veya in vitro ve in vivo hem de non-mezenşim soy sahip yapışık clonogenic hücrelerdir. 1-8,17,18 DPSCs ile tanımlanır olumsuz hematopoetik antijenlerin ekspresyonu (örneğin, CD45, CD34, CD14) ve CD90 pozitif ifadesi, CD29, CD73, CD105, CD44 ve STRO-1. 19,20

Minimum ağrı ve morbidite ile kolay elde potansiyeli valu olarak insan DPSCs yapmakMKH yapabiliyor kaynağı kemik iliği mezenkimal kök hücre 21 olarak sıradan kaynaklarına kıyasla. Genel olarak, DPSCs ya akıbet yöntemi, yani, pulpa dokusu eksplantlar (DPSC-OG) 22-24, ve / veya enzimatik sindirim (DPSC-ED) 4,6,25 kök hücrelerin göç ile izole edilmiştir. Önceki çalışmalar izolasyon yöntemi ve kültür koşullarında in vitro pasajlar 26,27 bölgesindeki altında farklı popülasyonlarda veya soy neden olduğunu göstermiştir. Kalıcı dişlerin (pDPSCs) söz konusu olduğunda, Huang ve ark enzimatik sindirimi pDPSCs geçmek DPSCs kıyasla daha yüksek çoğalma potansiyeli olduğunu ortaya koymuştur. Ayrıca 26, dişlerin (dDPSCs) söz konusu olduğunda, bu gösterilmiştir ki STRO-1 ve CD34 belirteçleri dDPSC-OG ile karşılaştırıldığında dDPSC-ED daha dile getirdi. Buna ek olarak, dDPSC-ED tanımlanan osteo / odonto ortam içinde daha yüksek bir mineralizasyon hızı görüntülenir. Bu nedenle 27 sebebiyle r DPSCs olağanüstü potansiyeliegenerative tıp, daha fazla çalışmaları farklı izolasyon yöntemleri türetilmiştir olası çeşitli popülasyonlarda daha iyi anlaşılması için gerekli olacaktır.

İşte, bu hamuru çıkarma sürecini kolaylaştırmak için bir adım diş elmas disketini kullanarak, hamuru ekstraksiyon kolay bir şekilde tanıtmak için bir girişimdi. Ayrıca ED veya OG yöntemleri uygulayarak insan pulpa kaynaklı kök hücrelerin izolasyonu sonra, iki grup arasında genel özellikleri ve farklılaşma kapasitesi de incelenmiştir.

Protocol

1. Enzim Çözüm ve Çoğalma Orta (PM) hazırlayın Kollajenaz Tip I olun Çözüm: kollajenaz tip I (12 mg / ml) tartılır ve bir 0.2 mikron şırınga filtresi kullanarak 1 ml PBS ve filtre içinde çözülür. Sonra 15 ml tüp yerleştirin ve gerektiği kadar -20 ° C'de saklayın. Çözelti dispase edin: dispase tartılır (16 mg / ml) ve 1 ml PBS ve filtre bir 0.2 um şırınga filtresi kullanılarak çözülür. Sonra 15 ml tüp yerleştirmek ve gerekti…

Representative Results

Enzimatik ayrışma (DPSC-ED) ile elde edildi DPSCs günde 10, 15,18 (Şekil 1) burada gösterilir. Dışlanmasının ardından yaklaşık 3 ila 5 gün oluşmaya başlayan koloniler. Geçmek DPSCs (DPSC-OG) günlük 5, 10, 13 ve 18, Şekil 2'de gösterilmiştir. Hücreleri paralel tohumlama sonra yaklaşık 5 gün tarafından sipariş ederek hamuru doku balonun içine göç etmeye başladılar Fibroblast benzeri. Her iki yöntem kullanılarak pasaj 3'de DPSCs Şekil …

Discussion

Bu protokol iki yöntem, enzimatik ayrışma ve pulpa dokusu eksplantlar alınan kök hücrelerin direkt sonucudur kullanarak diş hamurundan hDPSCs izolasyonu ve karakterizasyonu süreci anlatılmaktadır. Buna ek olarak, odontoblastlar bu hücrelerin in vitro olarak farklılaşma, kantitatif Alizarin Kırmızı S tahlil ve QPCR ile değerlendirildi.

İnsan dişinden pulpa dokusu izole etmek için mevcut protokoller pense (kemik forseps) 9, imha iğne 29, Gracey küret <…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz minnetle onun teknik destekler için onların eleştirel discus ve Sayın Mohammad Reza Khadem Şerif için Dr Leila Shakeri & Dr Aref Dournaei kabul ediyorsunuz.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue or Lot. number Comments (optional)
α-MEM GIBCO 11900-073
Collagenase type I Sigma-Aldrich C0130-100MG
Dispase GIBCO 17105-041
Penicillin/streptomycin GIBCO 15140-122
Amphotericin B GIBCO 15290-018
Fetal Bovine serum defined (FBS) HyClone SH30070.03
L-ascorbic acid 2-phosphate Sigma A8960-5G
L-glutamine GIBCO 25030-024
Dexamethasone Sigma D4902
β-Glycerol phosphate disodium salt hydrate, BioUltra Sigma G9422-100G
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5655
Osteogenesis Assay Kit Millipore PS01802031
Mouse IgG2b-PE isotype control BD pharmingen 50808088029
FITC mouse IgG2b isotype control BD pharmingen 559532
FITC mouse IgG1 κ isotype BD pharmingen 11471471
FITC/PE mouse anti-human CD34/CD45 BD pharmingen 341071
PE anti-human CD146 BD pharmingen 550315
Monoclonal mouse anti-human CD90/FITC Daka 00034418
PE mouse anti-human CD73 BD pharmingen 550257
Anti-h CD105/Endoglin PE BD pharmingen FAB10971P
PE mouse anti-human CD11b/Mac1 BD pharmingen 5553888
CD44 PE mouse anti human BD pharmingen 555479
Phosphate buffer Solution (PBS) GIBCO 003000
70-μm cell strainer Falcon 352360
0.2 μm syringe filter Millex-GV SLGV033RB
25 cm2 culture flask Sigma-Aldrich Z707481
EQUIPMENT
BD FACSCalibur BD 342975
multiskan microplate spectrophotometer Thermo scientific 51119200
Fleurcense Microscope Olympus
Flowing Software version 2.3.1
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Volponi, A. A., Pang, Y., Sharpe, P. T. Stem cell-based biological tooth repair and regeneration. Trends Cell Biol. 20, 715-722 (2010).
  2. Nosrat, I. V., Widenfalk, J., Olson, L., Nosrat, C. A. Dental pulp cells produce neurotrophic factors, interact with trigeminal neurons in vitro, and rescue motoneurons after spinal cord injury. Dev. Biol. 238, 120-132 (2001).
  3. Gandia, C., et al. Human dental pulp stem cells improve left ventricular function, induce angiogenesis, and reduce infarct size in rats with acute myocardial infarction. Stem Cells. 26, 638-645 (2008).
  4. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.. 97, 13625-13630 (2000).
  5. Graziano, A., d’Aquino, R., Laino, G., Papaccio, G. Dental pulp stem cells: a promising tool for bone regeneration. Stem Cell Rev. 4, 21-26 (2008).
  6. Kerkis, I., et al. Early transplantation of human immature dental pulp stem cells from baby teeth to golden retriever muscular dystrophy (GRMD) dogs: Local or systemic. J. Transl. Med. 6, 35 (2008).
  7. Onyekwelu, O., Seppala, M., Zoupa, M., Cobourne, M. T. Tooth development: 2. Regenerating teeth in the laboratory. Dent. Update. 34, 20-29 (2007).
  8. Cordeiro, M. M., et al. Dental pulp tissue engineering with stem cells from exfoliated deciduous teeth. J. Endod. 34 (08), 962-969 (2008).
  9. Pierdomenico, L., et al. Multipotent mesenchymal stem cells with immunosuppressive activity can be easily isolated from dental pulp. Transplantation. 80, 836-842 (2005).
  10. de Mendonca Costa, A., et al. Reconstruction of large cranial defects in nonimmunosuppressed experimental design with human dental pulp stem cells. J. Craniofac. Surg. 19, 204-210 (2008).
  11. Tirino, V., et al. Methods for the identification, characterization and banking of human DPSCs: current strategies and perspectives. Stem Cell Rev. 7, 608-615 (2011).
  12. Tirino, V., Paino, F., De Rosa, A., Papaccio, G. Identification, isolation, characterization, and banking of human dental pulp stem cells. Methods Mol. Biol. 879, 443-463 (2012).
  13. Eslaminejad, M. B., Vahabi, S., Shariati, M., Nazarian, H. In vitro Growth and Characterization of Stem Cells from Human Dental Pulp of Deciduous Versus Permanent Teeth. J. Dent. (Tehran). 7, 185-195 (2010).
  14. Wei, X., Ling, J., Wu, L., Liu, L., Xiao, Y. Expression of mineralization markers in dental pulp cells. J. Endod. 33, 703-708 (2007).
  15. Nombela-Arrieta, C., Ritz, J., Silberstein, L. E. The elusive nature and function of mesenchymal stem cells. Nat. Rev. Mol Cell Biol. 12, 126-131 (2011).
  16. Huang, G. T., Gronthos, S., Shi, S. Mesenchymal stem cells derived from dental tissues vs. those from other sources: their biology and role in regenerative medicine. J. Dent. Res. 88, 792-806 (2009).
  17. Graziano, A., et al. Scaffold’s surface geometry significantly affects human stem cell bone tissue engineering. J. Cell Physiol. 214, 166-172 (2008).
  18. d’Aquino, R., et al. Human dental pulp stem cells: from biology to clinical applications. J. Exp. Zool. B. Mol. Dev. Evol. 312, 408-415 (2009).
  19. Mitsiadis, T. A., Feki, A., Papaccio, G., Caton, J. Dental pulp stem cells, niches, and notch signaling in tooth injury. Adv. Dent. Res. 23, 275-279 (2011).
  20. Shi, S., Gronthos, S. Perivascular niche of postnatal mesenchymal stem cells in human bone marrow and dental pulp. J. Bone Miner. Res. 18, 696-704 (2003).
  21. Tomic, S., et al. Immunomodulatory properties of mesenchymal stem cells derived from dental pulp and dental follicle are susceptible to activation by toll-like receptor agonists. Stem Cells Dev. 20, 695-708 (2011).
  22. Tsukamoto, Y., et al. Mineralized nodule formation by cultures of human dental pulp-derived fibroblasts. Arch. Oral Biol. 37, 1045-1055 (1992).
  23. About, I., et al. Human dentin production in vitro. Exp. Cell Res. 258, 33-41 (2000).
  24. Couble, M. L., et al. Odontoblast differentiation of human dental pulp cells in explant cultures. Calcif. Tissue Int. 66, 129-138 (2000).
  25. Onishi, T., Kinoshita, S., Shintani, S., Sobue, S., Ooshima, T. Stimulation of proliferation and differentiation of dog dental pulp cells in serum-free culture medium by insulin-like growth factor. Arch. Oral Biol. 44 (99), 361-371 (1999).
  26. Huang, G. T., Sonoyama, W., Chen, J., Park, S. H. In vitro characterization of human dental pulp cells: various isolation methods and culturing environments. Cell Tissue Res. 324, 225-236 (2006).
  27. Bakopoulou, A., et al. Assessment of the impact of two different isolation methods on the osteo/odontogenic differentiation potential of human dental stem cells derived from deciduous teeth. Calcif. Tissue Int. 88, 130-141 (2011).
  28. Curtis, K. M., et al. EF1alpha and RPL13a represent normalization genes suitable for RT-qPCR analysis of bone marrow derived mesenchymal stem cells. BMC Mol. Biol. 11, 61 (2010).
  29. Suchanek, J., et al. Dental pulp stem cells and their characterization. Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czech Repub. 153, 31-35 (2009).
  30. d’Aquino, R., et al. Human postnatal dental pulp cells co-differentiate into osteoblasts and endotheliocytes: a pivotal synergy leading to adult bone tissue formation. Cell Death Differ. 14, 1162-1171 (2007).
  31. Atari, M., et al. Isolation of pluripotent stem cells from human third molar dental pulp. Histol. Histopathol. 26, 1057-1070 (2011).

Tags

IsolationCharacterizationComparative DifferentiationHuman Dental Pulp Stem CellsPermanent TeethTwo Different MethodsWisdom TeethRoutine Orthodontic TreatmentsHDPSCsProliferation PotentialMulti-lineage Differentiation CapacityAutologous TransplantationRegenerative MedicineMesenchymal Stem CellsMSC FeaturesImmunomodulatory EffectAllograft TransplantationIsolation ConditionsSurface MarkersDifferentiation CapacityImpacted Third Molar TeethDental Diamond Disk
check_url/fr/4372?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Karamzadeh, R., Eslaminejad, M. B., Aflatoonian, R. Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods. J. Vis. Exp. (69), e4372, doi:10.3791/4372 (2012).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image