使用屏幕在车身尺寸规例中的线虫基因介导的RNA干扰取食策略<em> C.线虫</em
Summary
我们演示了如何使用供给的RNAi技术敲除目标基因和分体尺寸型<em> C.线虫</em>。这种方法可用于大规模的画面，以找出潜在的基因成分，如在车身尺寸上的DBL-1/TGF-β信号调节。
Abstract
双链RNA介导的干扰（RNAi）是一种有效的策略，以击倒靶基因的表达1-3。它已被应用到许多模型系统，包括植物，无脊椎动物和脊椎动物。有各种各样的方法来实现RNAi 在体内 4,5。例如，可以与靶基因的RNAi载体转化，然后永久或瞬时转化的细胞系或初级细胞实现的基因敲除效果，或者从特定的靶基因（RNAi的寡核苷酸）的合成的双链寡核苷酸，可以是瞬时转化靶基因沉默的细胞系或原代细胞或合成的双链RNA分子可显微注射到生物体。由于线虫C.的利用细菌作为食物来源，饲养的动物与对靶基因的表达双链RNA的细菌提供了一个可行的策略。在这里，我们提出的RNAi输送机身尺寸表型的方法来得分。车身尺寸C.线虫主要受型TGF-β -等配位体DBL-1，所以该法是适合识别的TGF-β信号元件7。我们使用不同的菌株，其中包括两个RNA干扰过敏株重复供给的RNAi实验。我们的研究结果表明，RRF-3株给了我们最好的预期的RNAi表型。该方法易于操作，重现性好，易于量化。此外，我们的协议，最大限度地减少了使用专门的设备，所以它是适合于规模较小的实验室或主要是本科院校。
Protocol
1。准备携带目的基因序列的RNA干扰进料板如果使用市售的RNAi库（ 例如，从源生物科学生命科学），继续执行步骤1.4。另外，克隆到载体L4440，一种常用的蠕虫RNAi质粒8的靶基因序列，通过标准的克隆协议。 变换的菌株HT115（DE3）中，用25μg/ ml的羧苄青霉素的LB琼脂平板上培养和12.5微克/毫升四环素的重组质粒转化，并挑选单个克隆，以备将来使用。 同时，转换…
Representative Results
在我们的研究中，我们专注上机身尺寸调节的DBL-1/TGF-β途径。 DBL-1途径体型小，更短的车身长度相比，与野生型动物7,10,11功能的损失。因此，屏幕为C.线虫的机身尺寸突变体能够确定TGF-β信号组件和改性剂。 DBL-1信号是介导的一个保守的TGF-β的信号转导途径，其中包括细胞表面受体与细胞内的Smad信号传感器12。要测试的有效性的RNAi通过喂养的车身尺寸突变体的识别，我们?…
Discussion
在这个协议中，我们描述的车身尺寸有缺陷的突变体C.识别方法通过RNA干扰喂养的线虫 。此方法是适用于TGF-β信号分量的识别。由于这样的组件通过进化15是高度保守的，这样的屏幕是在所有后生动物阐明的分子机制的TGF-β信号有关。在这样的屏幕设计是一个重要的考虑出发菌株。我们已经证明，无论ERI-1，LIN-15b和RRF-3更敏感的RNAi喂养比对照菌株，这与以往的研…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢詹姆斯·C.克拉克为动物提供的数字，在不同的发育时间点。 的菌株在这项研究中获得的秀丽隐杆线虫的遗传学中心，这是由美国国立卫生研究院国家研究资源中心（NCRR）的支持。这项工作是从纽约市立大学支持的CIRG 1817 JL和惩教署和美国国立卫生研究院1R15GM073678-01和1R15GM097692-01，惩教署，我们感谢William水稻博士，博士娜塔莉亚·霍尔茨曼，梅丽莎Silvestrini的手稿上的评论。这项工作是进行在部分履行一个博士学位研究生中心纽约市立大学（S.雄）“的要求。
Materials
| RNAi worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Add 3 ml 1M IPTG(sterile) and 3 ml 25 mg/ml Carbenicillin(sterile); then pour into 60 mm Petri dishes. Worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 0.6 g Streptomycin Sulfate 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Pour into 60 mm Petri dishes. Worm Medium Mix 55 g Tris-Cl 24 g Tris-OH 310 g Bacto Peptone 800 mg Cholesterol 200 g NaCl Mix thoroughly and be sure to avoid chunks; this powdered mixture can be stored for many months prior to use. 2% agarose 0.5 g Agarose Add 25 ml dH2O. Heat in microwave until dissolved. 1M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 2 g IPTG Dissolve in10 ml dH2O 1M NaN3 6.5 g NaN3 Add dH2O to 100 ml 25 mM NaN3 2.5 ml 1M NaN3 Add dH2O to 100 ml Caenorhabditis elegans from Caenorhabditis Genetics Center L4440 plasmid (carries ampicillin-resistance gene) Bacteria strain HT115 (DE3) (contains IPTG inducible T7 polymerase; deficient for RNAse III gene (a dsRNAse) which also carries tetracycline-resistance gene)16 60 mm Petri dishes 100 mm Petri dishes 14 ml round-bottom Falcon culture tubes glass slides glass coverslips 1-20 μl pipettor 20-200 μl pipettor 200-1000 μl pipettor 1-200 μl pipet tips 200-1000 μl pipet tips 1.5 ml Eppendorf tubes platinum wire worm pick |
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Citer Cet Article
Liang, J., Xiong, S., Savage-Dunn, C. Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans. J. Vis. Exp. (72), e4373, doi:10.3791/4373 (2013).