Dissection, de la culture, et de l&#39;analyse des<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Tissus embryonnaires rétine

Résumé

Xenopus laevis fournit un système modèle idéal pour étudier la spécification du destin cellulaire et la fonction physiologique des différentes cellules rétiniennes en culture cellulaire primaire. Ici, nous présentons une technique de dissection des tissus rétiniens et générer des cultures de cellules primaires qui sont imagées pour l'activité de calcium et analysés par hybridation in situ.

Résumé

Le processus par lequel la région antérieure de la plaque neurale donne lieu à la rétine des vertébrés continue d'être une préoccupation majeure de la recherche clinique et fondamentale. En plus de la pertinence médical évident pour la compréhension et le traitement des maladies de la rétine, le développement de la rétine des vertébrés continue à servir de système modèle important pour la compréhension et élégant type cellulaire et la différenciation neuronale détermination ^1-16. La rétine neurale comprend six types de cellules discrètes (ganglion, photorécepteurs amacrines, horizontal, les cellules bipolaires, et les cellules gliales de Müller) disposés en couches stéréotypés, un motif qui est largement conservée parmi tous les vertébrés ^12,14-18.

Tout en étudiant la rétine de l'embryon intact le développement est clairement nécessaire pour comprendre comment cet organe complexe se développe à partir d'une saillie du cerveau antérieur dans une structure en couches, il ya beaucoup de questions qui profitent vientm employant des approches utilisant la culture cellulaire primaire de présumées cellules rétiniennes ^7,19-23. Par exemple, en analysant les cellules de tissus prélevés et dissociés à des stades différents permet de discerner l'état de la spécification de cellules individuelles à différents stades de développement, qui est, le sort des cellules en l'absence d'interaction avec les tissus voisins ^{8,19-22 ,24-33.} Culture de cellules primaires permet également au chercheur de traiter la culture avec des réactifs spécifiques et analyser les résultats au niveau unicellulaire ^{5,8,21,24,27-30,33-39.} Xenopus laevis, un système modèle classique pour l'étude des le développement neural précoce ^{19,27,29,31-32,40-42,} sert de système particulièrement adapté à la culture des cellules rétiniennes primaires ^10,38,43-45.

Présomption de tissu rétinien est accessible dès les premiers stades de développement, immédiatement après l'induction neurale ^25,38,43. En outre, étant donné eà chaque cellule de l'embryon contient une réserve de jaune d'œuf, les cellules rétiniennes peuvent être cultivées dans un milieu très simples définis constituées d'une solution saline tamponnée, éliminant ainsi les effets de confusion d'incubation ou d'autres sérums à base de produits ^10,24,44-45 .

Cependant, l'isolement du tissu rétinien à partir des tissus environnants et le traitement subséquent est un défi. Ici, nous présentons une méthode pour la dissection et la dissociation des cellules de la rétine dans Xenopus laevis qui seront utilisés pour préparer des cultures de cellules primaires qui, à leur tour, être analysés pour l'activité de calcium et de l'expression des gènes à la résolution de cellules individuelles. Bien que le sujet présenté dans cet article est l'analyse des transitoires calciques spontanées, la technique est largement applicable à un large éventail de questions de recherche et des approches (Figure 1).

Protocole

Toutes les expériences sont réalisées selon des protocoles approuvés par le soin des animaux et du Comité institutionnel utilisation au College of William and Mary. Stades de développement mentionnés dans le présent protocole sont conformes à Nieuwkoop et Faber ^46.

1. Dissection

1. Laisser le milieu de culture cellulaire et de magnésium de calcium libre moyen (CMF) s'équilibrer à la température ambiante. Vous devrez également 0,1 X de Marc jour Ringer (ROR) pH 7,4-7,6.
2. Stériliser les éléments suivants en appliquant une lumière UV pendant 30 min sous une hotte à flux laminaire de culture cellulaire. (Vapori....

Résultats

Des exemples de succès disséqués vésicules optiques (étape 25) et la rétine (stade 35) sont présentés dans les figures 2E et 2J. Bien que ce protocole peut être utilisé à différents stades de développement, il est essentiel d'obtenir que le tissu rétinien pour assurer l'exactitude pour d'autres expériences. Retirez délicatement l'épiderme à tous les stades et s'assurer que vos pinces à ne pas percer le tissu rétinien. Dans l'étape 35 ans ou plus, la lentille peut être considérée .......

Discussion

Avec ses types cellulaires bien caractérisées qui sont conservées dans tous les vertébrés, la rétine fournit un modèle utile pour l'étude des processus cellulaires qui régissent moléculaire spécification du type cellulaire et la différenciation. Culture de cellules primaires donne une puissante méthode pour étudier un grand nombre de processus, y compris l'expression des gènes, la dynamique des protéines et du calcium et de l'activité électrique au niveau de la résolution cellule unique. Nous présentons ici .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue
			Pour dissections et la culture
BD Falcon Facile Plats Grip Culture de tissus, 35 mm	Pêcheur	08-772A
Boîtes de Pétri jetables en polystyrène, 60 x 15 mm	Pêcheur	0875713A
35 mm Surface Nunclon boîtes de Pétri (avec Airvent)	Pêcheur	12-565-91
Dumont fin forceps (Dumostar # 55)	Pêcheur	NC9341917
Cellattice Micro-jugé en plastique lamelle 25 mm	Pêcheur	50-313-17
Éthyl-m-aminobenzoate Methanesulfonate Sel (MS-222)	MP Biomedicals, LLC	103106
Sulfate de gentamicine	Enzo Life Sciences	380 à 003-G025
Gibco trypsine (1:250) Poudre	Life Technologies	27250-018
Collagénase B de Clostridium histolyticum	Roche	11088831001
Pénicilline-streptomycine	Gibco	15140-122
Nil Bleu Sulfate (facultatif)	Pfaltz & Bauer	N05550
Vide de 500 ml Bouteille Filter System / Storage, 0,22 um des pores membranaires CN 33,2 cm 2	Corning	430758
			Pour l'imagerie calcique
Fluo-4 AM 1 Solution mM dans du DMSO, Cell permanent	Life Technologies	F-14217
Solution Pluronic F-127 10% dans l'eau	Life Technologies	P-6866
LSM 510 Système Microscope confocal	Zeiss	Modèle Discontinued
Blocage réactif	Roche	11096176001
			Pour hybridation fluorescente in situ (FISH)
Anti-digoxigénine-POD, Fab Fragments	Roche	11207733910
Anti-DNP-HRP anticorps	Perkin-Elmer	NEL747A
Cy3Ester de NHS	GE Healthcare	PA13101
NHS-fluorescéine	Thermo Scientific	46409
Formamide, déminéralisée	Amresco	0606-950ML
Torula ARN, de type IX	Sigma-Aldrich	R3629
Sel de sodium de l'héparine, de muqueuse intestinale de porc	Sigma-Aldrich	H3393-250KU
CHAPS	Sigma-Aldrich	C3023
			Tableau 2. Réactifs et équipements spécifiques.
			Solution Référence Contenu Milieu de culture cellulaire Chang et Spitzer, 2009 54 116 mM de NaCl 0,67 mM KCl 2 mM de CaCl2 1,31 mM MgSO 4 4,6 mM de Tris 1% (v: v) Pénicilline / Streptomycine Ajuster le pH à 7,8 avec HCl. Stériliser par filtration en passant à travers un filtre de 0,22 um CN. Stocker à 4 ° C. Calcium-Magnesium moyen gratuit (CMF) Gu et al, 1994 42;. Gu et Spitzer, 1995 55 116 mM de NaCl 0,67 mM KCl 4,6 mM de Tris 0,4 mM d'EDTA 1% (v: v) Pénicilline / Streptomycine Ajuster le pH à 7,8 avec HCl. Stériliser par filtration en passant à travers un filtre de 0,22 um CN. Stocker à 4 ° C. Tampon acide maléique (MAB) Sive et al., 2000 53 100 mM d'acide maléique NaCl 150 mM (pH 7,5). Marc Ringer à jour (ROR), 10X Sive et al., 2000 53 NaCl 100 mM mM KCl 1 mM MgSO 4 2 mM de CaCl2 HEPES 5 mM pH ajusté à 7,4 avec NaOH 0,1 X MMR contient également 50 mg / ml de sulfate de gentamicine et le pH est ajusté à 7,4 avec NaOH. Solution MEMFA, 10X Sive et al., 2000 53 0,1 M MOPS (pH 7,4) EGTA 2 mM 1 mM MgSO 4 Formaldéhyde 3,7% Une solution 10X, sans formaldéhyde, peuvent être conservés à 4 ° C. Le formaldéhyde est ajouté fraîche (1/10 de volume d'un stock standard 37%). Dans tampon d'hybridation in situ Sive et al., 2000 53 Le formamide 50% 5X SSC 1 mg / ml d'ARN Torula 100 mg / ml d'héparine 1X Denhart de Solution 0,1% de Tween 20 CHAPS 0,1% 10 mM d'EDTA. Solutions. * Gentamicine, un antibiotique, est utilisée dans nos solutions ROR alors la pénicilline et de la streptomycine sont utilisés dans nos milieux de culture.