Dissection, de la culture, et de l'analyse des<em> Xenopus laevis</em> Tissus embryonnaires rétine

Summary

Xenopus laevis fournit un système modèle idéal pour étudier la spécification du destin cellulaire et la fonction physiologique des différentes cellules rétiniennes en culture cellulaire primaire. Ici, nous présentons une technique de dissection des tissus rétiniens et générer des cultures de cellules primaires qui sont imagées pour l'activité de calcium et analysés par hybridation in situ.

Abstract

Le processus par lequel la région antérieure de la plaque neurale donne lieu à la rétine des vertébrés continue d'être une préoccupation majeure de la recherche clinique et fondamentale. En plus de la pertinence médical évident pour la compréhension et le traitement des maladies de la rétine, le développement de la rétine des vertébrés continue à servir de système modèle important pour la compréhension et élégant type cellulaire et la différenciation neuronale détermination ^1-16. La rétine neurale comprend six types de cellules discrètes (ganglion, photorécepteurs amacrines, horizontal, les cellules bipolaires, et les cellules gliales de Müller) disposés en couches stéréotypés, un motif qui est largement conservée parmi tous les vertébrés ^12,14-18.

Tout en étudiant la rétine de l'embryon intact le développement est clairement nécessaire pour comprendre comment cet organe complexe se développe à partir d'une saillie du cerveau antérieur dans une structure en couches, il ya beaucoup de questions qui profitent vientm employant des approches utilisant la culture cellulaire primaire de présumées cellules rétiniennes ^7,19-23. Par exemple, en analysant les cellules de tissus prélevés et dissociés à des stades différents permet de discerner l'état de la spécification de cellules individuelles à différents stades de développement, qui est, le sort des cellules en l'absence d'interaction avec les tissus voisins ^{8,19-22 ,24-33.} Culture de cellules primaires permet également au chercheur de traiter la culture avec des réactifs spécifiques et analyser les résultats au niveau unicellulaire ^{5,8,21,24,27-30,33-39.} Xenopus laevis, un système modèle classique pour l'étude des le développement neural précoce ^{19,27,29,31-32,40-42,} sert de système particulièrement adapté à la culture des cellules rétiniennes primaires ^10,38,43-45.

Présomption de tissu rétinien est accessible dès les premiers stades de développement, immédiatement après l'induction neurale ^25,38,43. En outre, étant donné eà chaque cellule de l'embryon contient une réserve de jaune d'œuf, les cellules rétiniennes peuvent être cultivées dans un milieu très simples définis constituées d'une solution saline tamponnée, éliminant ainsi les effets de confusion d'incubation ou d'autres sérums à base de produits ^10,24,44-45 .

Cependant, l'isolement du tissu rétinien à partir des tissus environnants et le traitement subséquent est un défi. Ici, nous présentons une méthode pour la dissection et la dissociation des cellules de la rétine dans Xenopus laevis qui seront utilisés pour préparer des cultures de cellules primaires qui, à leur tour, être analysés pour l'activité de calcium et de l'expression des gènes à la résolution de cellules individuelles. Bien que le sujet présenté dans cet article est l'analyse des transitoires calciques spontanées, la technique est largement applicable à un large éventail de questions de recherche et des approches (Figure 1).

Protocol

Toutes les expériences sont réalisées selon des protocoles approuvés par le soin des animaux et du Comité institutionnel utilisation au College of William and Mary. Stades de développement mentionnés dans le présent protocole sont conformes à Nieuwkoop et Faber 46. 1. Dissection Laisser le milieu de culture cellulaire et de magnésium de calcium libre moyen (CMF) s'équilibrer à la température ambiante. Vous devrez également 0,1 X de Marc jour Ringer (RO…

Representative Results

Des exemples de succès disséqués vésicules optiques (étape 25) et la rétine (stade 35) sont présentés dans les figures 2E et 2J. Bien que ce protocole peut être utilisé à différents stades de développement, il est essentiel d'obtenir que le tissu rétinien pour assurer l'exactitude pour d'autres expériences. Retirez délicatement l'épiderme à tous les stades et s'assurer que vos pinces à ne pas percer le tissu rétinien. Dans l'étape 35 ans ou plus, la lentille …

Discussion

Avec ses types cellulaires bien caractérisées qui sont conservées dans tous les vertébrés, la rétine fournit un modèle utile pour l'étude des processus cellulaires qui régissent moléculaire spécification du type cellulaire et la différenciation. Culture de cellules primaires donne une puissante méthode pour étudier un grand nombre de processus, y compris l'expression des gènes, la dynamique des protéines et du calcium et de l'activité électrique au niveau de la résolution cellule unique. N…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
			For Dissections and Culturing
BD Falcon Easy Grip Tissue Culture Dishes, 35 mm	Fisher	08-772A
Disposable Polystyrene Petri Dishes, 60 x 15 mm	Fisher	0875713A
35 mm Nunclon Surface Petri Dishes (with Airvent)	Fisher	12-565-91
Dumont Fine Forceps (Dumostar #55)	Fisher	NC9341917
Cellattice Micro-ruled plastic coverslip, 25 mm	Fisher	50-313-17
Ethyl-m-Aminobenzoate Methanesulfonate Salt (MS-222)	MP Biomedicals, LLC	103106
Gentamicin Sulfate	Enzo Life Sciences	380-003-G025
Gibco Trypsin (1:250) Powder	Life Technologies	27250-018
Collagenase B from Clostridium histolyticum	Roche	11088831001
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Nile Blue Sulfate (optional)	Pfaltz & Bauer	N05550
500 ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 μm Pore 33.2 cm2 CN Membrane	Corning	430758
			For Calcium Imaging
Fluo-4 AM 1 mM Solution in DMSO, Cell Permanent	Life Technologies	F-14217
Pluronic F-127 10% Solution in Water	Life Technologies	P-6866
LSM 510 Confocal Microscope System	Zeiss	Model Discontinued
Blocking Reagent	Roche	11096176001
			For Fluorescent in situ hybridization (FISH)
Anti-Digoxigenin-POD, Fab Fragments	Roche	11207733910
Anti-DNP-HRP Antibody	Perkin-Elmer	NEL747A
Cy3 NHS ester	GE Healthcare	PA13101
NHS-Fluorescein	Thermo Scientific	46409
Formamide, Deionized	Amresco	0606-950ML
Torula RNA, Type IX	Sigma-Aldrich	R3629
Heparin Sodium Salt, from Porcine Intestinal Mucosa	Sigma-Aldrich	H3393-250KU
CHAPS	Sigma-Aldrich	C3023
			Table 2. Specific reagents and equipment.
			Solution Reference Contents Cell Culture Medium Chang and Spitzer , 200954 116 mM NaCl 0.67 mM KCl 2 mM CaCl2 1.31 mM MgSO4 4.6 mM Tris 1 % (v:v) Penicillin/Streptomycin Adjust pH to 7.8 with HCl. Filter sterilize by passing through a 0.22 μm CN filter. Store at 4 °C. Calcium-Magnesium Free Medium (CMF) Gu et al., 199442; Gu and Spitzer, 199555 116 mM NaCl 0.67 mM KCl 4.6 mM Tris 0.4 mM EDTA 1 % (v:v) Penicillin/Streptomycin Adjust pH to 7.8 with HCl. Filter sterilize by passing through a 0.22 μm CN filter. Store at 4 °C. Maleic Acid Buffer (MAB) Sive et al., 200053 100 mM maleic acid 150 mM NaCl (pH 7.5). Marc’s Modified Ringers (MMR), 10X Sive et al., 200053 100 mM NaCl mM KCl 1 mM MgSO4 2 mM CaCl2 5 mM HEPES pH adjusted to 7.4 with NaOH 0.1X MMR also contains 50 mg/ml gentamicin sulfate and pH is adjusted to 7.4 with NaOH. MEMFA Solution, 10X Sive et al., 200053 0.1 M MOPS (Ph 7.4) 2 mM EGTA 1 mM MgSO4 3.7% formaldehyde A 10X solution, without formaldehyde, can be stored at 4 °C. Formaldehyde is added fresh (1/10 volume of a standard 37% stock). In situ Hybridization Buffer Sive et al., 200053 50% Formamide 5X SSC 1 mg/ml Torula RNA 100 mg/ml Heparin 1X Denhart’s Solution 0.1% Tween 20 0.1% CHAPS 10 mM EDTA. Solutions. *Gentamicin, an antibiotic, is used in our MMR solutions while penicillin and streptomycin are used in our culture media.