Analyse av snare-mediert membran fusion Bruke en Enzymatisk Cell Fusion Assay
Summary
Vi har utviklet en cellefusjon assay som kvantifiserer snare-medierte membran fusion hendelser etter aktivert ekspresjon av β-galaktosidase.
Abstract
Interaksjonene mellom Snare (s oluble N-etylmaleimid-sensitive faktor en ttachment protein re ceptor) proteiner på vesikler (v-Snares) og på målet membraner (t-Snares) katalysere intracellulær vesicle fusjon 1-4. Reconstitution analyser er avgjørende for dissekere mekanismen og regulering av snare-mediert membran fusion 5. I en cellefusjon assay 6,7, er snare proteiner uttrykt ectopically på celleoverflaten. Disse "venda" Snare proteiner drive celle-celle fusion, viser at snarer er tilstrekkelig til å smelte cellemembraner. Fordi cellefusjon Forsøket er basert på mikroskopisk analyse, er det mindre effektivt når det brukes til å analysere flere v-og t-snare interaksjoner kvantitativt.
Her beskriver vi en ny assay 8 som kvantifiserer snare-medierte cellefusjon hendelser etter aktivert ekspresjon av β-galaktosidase. Tokomponenter av Tet-Off genuttrykksystem 9 brukes som en avlesning system: tetracyklin-kontrollerte transactivator (TTA) og en reporter plasmid som koder LacZ-genet under kontroll av tetracyklin-responselement (TRE-LacZ). Vi transfektere TTA inn COS-7 celler som uttrykker venda v-snare proteiner på celleoverflaten (V-celler) og transfektere TRE-LacZ i COS-7 celler som uttrykker venda t-snare proteiner på celleoverflaten (t-celler) . Snare-avhengige fusjon av de V-og T-celler resulterer i bindingen av TTA til TRE, den transkripsjonelle aktivering av LacZ og uttrykk for β-galaktosidase. Aktiviteten av β-galaktosidase er kvantifisert ved hjelp av en kolorimetrisk metode ved absorbans ved 420 nm.
De vesikkel-tilknyttede membran proteiner (Vamps) er v-Snares som bor i ulike post-Golgi vesikulær avdelinger 10-15. Ved å uttrykke en Vamps, 3, 4, 5, 7 og 8 på samme nivå, sammenligner vi deres membran fusionaktiviteter ved hjelp av enzymatisk cellefusjon analysen. Basert på spektrometrisk måling, tilbyr denne analysen en kvantitativ tilnærming for å analysere snare-mediert membran fusion og for høy gjennomstrømming studier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den opprinnelige cellefusjon analysen 6 fastsetter snare-medierte cellefusjon hendelser ved fluorescens mikroskopi. Her beskriver vi en nyskapende analyse som kvantifiserer snare-medierte cellefusjon hendelser ved aktivert uttrykk for β-galaktosidase og spektrometrisk måling. Ved hjelp av denne analysen, vi rutinemessig analyserer 15-20 v-og t-snare kombinasjoner i et enkelt eksperiment. Bruke flowcytometri å måle Snare uttrykk på celleoverflaten, titrere vi uttrykket nivåer av Vamps og sammenligne dere…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet støttes av oppstart midler fra University of Louisville og CA135123 fra National Institutes of Health (til CH).
Materials
| Name of reagent and equipment | Company | Catalog number |
| DMEM | Invitrogen | 12800-017 |
| COS-7 cells | ATCC | CRL-1651 |
| tunicamycin | Sigma-Aldrich | T7765-5MG |
| pTet-Off | Clontech | K1620-A |
| pBI-G | Clontech | 6150-1 |
| lipofectamine | Invitrogen | 18324-012 |
| Enzyme-free cell dissociation solution | Invitrogen | 13151-014 |
| Rabbit anti-TET Repressor polyclonal antibody | Millipore | AB3541 |
| FITC-conjugated donkey anti-mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-095-150 |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 |
| FACSCalibur flow cytometer | BD Biosciences | |
| β-Galactosidase Enzyme Assay System with Reporter Lysis Buffer | Promega | E2000 |
| Model 100-40 UV-VIS spectrophotometer | Hitachi | C740843 |
References
- Rothman, J. E. Mechanisms of intracellular protein transport. Nature. 372, 55-63 (1994).
- Jahn, R., Lang, T., Sudhof, T. C. Membrane fusion. Cell. 112, 519-533 (2003).
- Bonifacino, J. S., Glick, B. S. The mechanisms of vesicle budding and fusion. Cell. 116, 153-166 (2004).
- Jahn, R., Scheller, R. H. SNAREs–engines for membrane fusion. Nature. 7, 631-643 (2006).
- Weber, T. SNAREpins: minimal machinery for membrane fusion. Cell. 92, 759-772 (1998).
- Hu, C. Fusion of cells by flipped SNAREs. Science (New York, N.Y). 300, 1745-1749 (2003).
- Hu, C., Hardee, D., Minnear, F. Membrane fusion by VAMP3 and plasma membrane t-SNAREs. Experimental cell research. 313, 3198-3209 (2007).
- Hasan, N., Corbin, D., Hu, C. Fusogenic Pairings of Vesicle-Associated Membrane Proteins (VAMPs) and Plasma Membrane t-SNAREs – VAMP5 as the Exception. PloS one. 5, e14238 (2010).
- Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 5547-5551 (1992).
- Hanson, P. I., Heuser, J. E., Jahn, R. Neurotransmitter release – four years of SNARE complexes. Current opinion in neurobiology. 7, 310-315 (1997).
- McMahon, H. T. Cellubrevin is a ubiquitous tetanus-toxin substrate homologous to a putative synaptic vesicle fusion protein. [see comments. Nature. 364, 346-349 (1993).
- Steegmaier, M., Klumperman, J., Foletti, D. L., Yoo, J. S., Scheller, R. H. Vesicle-associated membrane protein 4 is implicated in trans-Golgi network vesicle trafficking. Molecular biology of the cell. 10, 1957-1972 (1999).
- Zeng, Q. A novel synaptobrevin/VAMP homologous protein (VAMP5) is increased during in vitro myogenesis and present in the plasma membrane. Molecular biology of the cell. 9, 2423-2437 (1998).
- Galli, T. A novel tetanus neurotoxin-insensitive vesicle-associated membrane protein in SNARE complexes of the apical plasma membrane of epithelial cells. Molecular biology of the cell. 9, 1437-1448 (1998).
- Wong, S. H. Endobrevin, a novel synaptobrevin/VAMP-like protein preferentially associated with the early endosome. Molecular biology of the cell. 9, 1549-1563 (1998).
