En høy-innhold screening metode for identifisering av nye signalering kompetente transmembrane reseptorer er beskrevet. Denne metoden er mottagelig for storskala automatisering og lar spådommer om<em> In vivo</em> Proteinbinding og sub-cellulær lokalisering av protein komplekser i mammalske celler.
Signaltransduksjon ved vekstfaktorreseptorer er avgjørende for celler å opprettholde proliferasjon og differensiering og krever streng kontroll. Signaltransduksjon er initiert ved binding av en ekstern ligand til et transmembrant reseptor og aktivering av nedstrøms signalnettverk kaskader. En viktig regulator av mitogen signalering er Grb2, et modulært protein består av en intern SH2 (SRC Homologi 2) domene flankert av to SH3 domener som mangler enzymatisk aktivitet. Grb2 er konstitutivt knyttet til GTPase Son Of Sevenless (SOS) via sin N-terminal SH3 domene. Den SH2 domene Grb2 binder seg til vekstfaktorreseptorer på fosforylerte tyrosinresiduene dermed kopling reseptoraktivering til SOS-Ras-MAP kinase signalisering kaskade. I tillegg har andre roller for Grb2 som en positiv eller negativ regulator av signalering og reseptor endocytose blitt beskrevet. Den modulære sammensetningen av Grb2 tyder på at det kan dokke til en rekke reseptorer og transduce signaler langs en rekke forskjellige baner 1-3.
Beskrevet her er en enkel mikroskopi analysen som overvåker rekruttering av Grb2 til plasmamembranen. Den er tilpasset fra en metode som måler endringer i sub-cellulær lokalisering av grønn-fluorescerende protein (GFP)-merket Grb2 i respons på en stimulus 4-6. Plasma membran reseptorer som binder Grb2 eksempel aktivert Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) rekruttere GFP-Grb2 til plasmamembranen upon cDNA uttrykk og senere omplassering til endosomal oppbevaringsrom i cellen. For å identifisere in vivo protein komplekser av Grb2, kan denne teknikken brukes til å utføre et genom-wide høyt innhold skjermen basert på endringer i Grb2 sub-cellulær lokalisering. Fremstillingen av cDNA-kloner, expression transfeksjon og bildefangst er beskrevet detaljert nedenfor. Sammenlignet med andre genomisk metoder som brukes til å identifisere protein interaksjon partnere, for eksempel gjær-to-hybrid, gjør denne teknikken visualisering av protein komplekser i pattedyrceller på sub-mobilnettet stedet for interaksjon med en enkel mikroskopi-baserte analysen. Derav både kvalitative funksjoner, for eksempel mønstre av lokalisering kan vurderes, samt den kvantitative styrken av interaksjonen.
Expression kloning er et kraftig verktøy som har vært brukt i fortiden for å identifisere nye cellulære komponenter som virus reseptorer og blodceller antigener 12. Her beskriver vi en fremgangsmåte for å lette identifisering av nye formodede signaltransduksjon reseptorer som bindes til Grb2.
Det er noen kritiske trinn i protokollen.
Den Grb2 translokasjon analysen har blitt brukt av andre gruppe for å identifisere små molekyl inhibitorer av EGFR kinase aktivering 6. I så tilfelle er det EGFR spesifikt aktivert med ligand forårsaker rekruttering av Grb2 til plasmamembranen. Forstyrrelse av denne interaksjonen kan deretter bli undersøkt ved hjelp av små molekyl forbindelser. Likeledes kan det tenkes at siRNA skjermer kan anvendes for å identifisere endogene gener involvert i EGFR-Grb2 signalisering eller andre Grb2-bindende vekstfaktor reseptorer slik som c-kit eller erytropoietinreseptoren. Dermed er det flere mulige bruksområder for denne teknikken. En tilsvarende tilnærming kan brukes til GFP-merket reporter systemer for andre adapter molekyler som SHC, Gab eller skattemyndighetene.
En stor fordel med å bruke denne cellebasert assay i pattedyrceller er at det muliggjør identifisering av fysiologisk relevant interaksjoner. Analysen er en avlesning for protein kompleks dannelse, men enda viktigere, de relevante interaksjoner overvåkes riktig sub-cellulære område. I denne forbindelse, overvinner denne teknikken gjenstander fra andre protein-protein interaksjon metoder som gjær-to-hybrid eller in vitro-analyser. Det bør bemerkes imidlertid at indirekte interaksjoner kan også resultere i Grb2 rekruttering. Tilsvarende kan den transkripsjonelle oppregulering av bindingspartnere bli indusert av cDNA uttrykk. For å skille mellom disse muligheter, er det nødvendig å utføre de hensiktsmessige sekundære analyser for å skille mellom direkte og indirekte bindingseffektene.
I konklusjonen, lover GFP-adapter molekyl translokasjon analysen stort potensial for genom-wide screening og drug discovery programmer.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Medical Research Council og Marie-Curie International Reintegration Grant ordningen (til JKV).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
cDNA library | Origene | ||
LB+amp | |||
Gas-permeable seals | ThermoScientific | AB-0718 | |
Nucleospin 96 Plasmid Kit | Macherey-Nagel | 740625.4 | |
Transfectin | BioRad | 170-3351 | |
Hoechst33342 | Molecular Probes | H3570 | |
Viewplate 96 F TC | PerkinElmer | 6005182 | |
RapidPick | Hudson | Norgren CP7200 | |
Freedom Evo | Tecan | With vacuum manifold | |
Multidrop 384 | Thermo | ||
Opera LX | PerkinElmer |