Timing chromosome Réplication Combiné avec fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridation

Résumé

Procédé pour l'analyse quantitative de la réplication du chromosome de synchronisation est décrit. La méthode utilise l'incorporation de BrdU en combinaison avec fluorescent In situ Hybridation (FISH) afin d'évaluer le calendrier de réplication des chromosomes de mammifères. Cette technique permet la comparaison directe des chromosomes réarrangés et non réarrangé dans la même cellule.

Résumé

Réplication de l'ADN des mammifères initie à plusieurs endroits le long des chromosomes à différents moments au cours de la phase S, la suite d'un programme de réplication temporelle. La spécification de la synchronisation de réplication est considéré comme un processus dynamique régulée par des signaux spécifiques de tissus et de développement qui répondent aux modifications épigénétiques. Cependant, les mécanismes de régulation où et quand réplication de l'ADN initie le long des chromosomes reste mal comprise. Chromosomes homologues généralement se répliquer de manière synchrone, mais il ya des exceptions notables à cette règle. Par exemple, dans les cellules de mammifères femelles l'un des deux chromosomes X devient une réplication tardive par le biais d'un processus appelé inactivation du chromosome X ^1. Avec ce retard dans le calendrier de réplication, estimé à 2-3 h, la majorité des gènes transcriptionnellement silencieux deviennent le seul chromosome X. En outre, un discret agissant en cis lieu, connu comme le centre inactivation du chromosome X, réglemente ce processus inactivation du chromosome X, y compris èmee induction de la réplication temps différé sur le chromosome X inactif entier. En outre, certains réarrangements chromosomiques trouvés dans les cellules cancéreuses et les cellules exposées à des rayonnements ionisants afficher un retard important dans le calendrier de la réplication> 3 heures qui affecte le chromosome entier ^2,3. Des travaux récents de notre laboratoire indiquent que la perturbation de discret agissant en cis autosomique résultat loci dans un phénotype extrêmement réplication tardive qui affecte l'ensemble du chromosome ^4. Études 'ingénierie chromosomique »supplémentaires indiquent que les réarrangements chromosomiques affectant certains nombre de résultats différents chromosomes anormal dans ce moment-phénotype de réplication, ce qui suggère que tous les chromosomes de mammifères contiennent discrets agissant en cis locus qui contrôlent le calendrier de réplication des chromosomes individuels ^5.

Ici, nous présentons une méthode pour l'analyse quantitative de la synchronisation de réplication chromosomique associée à hybridation fluorescente in situ. Cetteméthode permet une comparaison directe de la synchronisation de la réplication entre chromosomes homologues au sein de la même cellule, et a été adapté à partir de ^6. En outre, cette méthode permet l'identification sans ambiguïté des réarrangements chromosomiques qui sont en corrélation avec l'évolution du calendrier de réplication qui influent sur le chromosome entier. Cette méthode présente des avantages par rapport élaboré récemment débit micro-array haut ou le séquençage protocoles qui ne peuvent distinguer entre les allèles homologues présents sur réorganisées et non réorganisées-chromosomes. En outre, parce que la méthode décrite ici évalue cellules individuelles, il peut détecter des changements dans le calendrier sur la réplication des chromosomes réarrangements chromosomiques qui sont présents dans seulement une fraction des cellules dans une population.

Protocole

1. L'incorporation de BrdU (repérage des bornes)

1. Cellules de la plaque à environ 70% de confluence dans une culture de tissu plat 150 mm 24 h avant l'addition de BrdU.
2. Remplacez le support avec des produits frais milieu complet contenant 20 ug / ml de BrdU (Sigma) à des moments appropriés avant la récolte. La longueur de temps sont les cellules cultivées dans des milieux avec BrdU varient selon le type cellulaire et des espèces, généralement la phase G2 dure entre 2 et 5 heures (figure 1).

2. Récolte chromosomique des cultures monocouches de cellules

1. Retirer des milieux de cul....

Résultats

Un exemple de l'analyse de la synchronisation de réplication du chromosome 6 humain est montré dans la figure 2. Des cellules contenant une délétion du gène ASAR6 ^4, situé à 6q16.1, ont été exposés à BrdU pendant 5 heures, la récolte des cellules mitotiques et traitées de FISH avec une sonde de peinture chromosomique 6 (Vysis) et pour l'incorporation de BrdU. Notez qu'il ya une différence significative dans le modèle de BrdU bandes entre le deux 6, ce qui correspond à un retard da.......

Discussion

La préparation des étalements de chromosomes est une étape cruciale pour la réussite de la réplication de synchronisation essai décrit ici. L'inclusion d'une étape de prétraitement colcémide avant le traitement hypotonique peut aider à la fréquence et la propagation des cellules mitotiques. En général, nous exposer les cellules à colcemdi pendant 1-3 heures avant la récolte, et l'utilisation colcémide à une concentration finale de 10 ug / ml. Toutefois, l'inclusion d'une étape de prétraitement colcém.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires (optionnel)
Anti-BrdU-FITC	Roche Millipore	11202593001 MAB326F	50 ug / ul
Nick Translation Kit	Abbott Molecular (Vysis)	07J00-0001
Spectrum Orange dUTP	Abbott Molecular (Vysis)	02N33-050
CEP	Abbott Molecular (Vysis)	Varie
Tampon d'hybridation INS / PCM	Abbott Molecular (Vysis)	06J67-011
Tampon d'hybridation CEP	Abbott Molecular (Vysis)	07J36-001
Chromosome paints	Métasystèmes Groupe	D-14NN-050-TR
Olympus BX61 microscope à fluorescence	Olympe	BX61TRF-1-5
Système logiciel microscope d'imagerie	Applied Imaging	Cytovision 3.93.1
Appareil photo numérique	Olympe	UCMAD3
			EN RECETTES hybridation in situ Solutions Formamide 70% Formamide/2x SSC 35 ml formamide * (Sigma) 10 ml 10x SSC 5 ml d 2 H 2 0 pH à 7,0 avec HCl (Sigma) * Il est important d'utiliser le formamide qui a été stocké à -20 ° C. Stockage prolongé température ambiante va générer l'acide formique et le pH wmal-être trop bas. 50% Formamide/2x SSC 25 ml de formamide (Sigma) 10 ml 10x SSC 15 ml dH 2 O pH à 7,0 avec HCl (Sigma) 20x SSC, 4 L 702 g de NaCl (Sigma) 358 g de citrate de sodium (Sigma) dH 2 O en volume PN tampon [0,1 M NaP0 4 0,1% NP_40 (Sigma)] Préparer une solution à 0,1 M de phosphate de sodium chacun (Filtre stériliser et stocker en aliquots ml 500). 0,1 M de NaH 2 P0 4, 1 L 13,8 g de NaH 2 P0 4 (Sigma): dH 2 O en volume 0,1 M de NaH 2 P0 4 1 L 14,2 g de NaH 2 P0 4 (Sigma) dH 2 O en volume. PN: Ajuster le pH de 0,1 M Na 2 HP0 4 à pH 8,0 avec 0,1 M NaH 2 P0 4. Stériliser par filtration et ajouter 1 ml de NP-40. PNM 50 ml 1,25 g Non lait écrémé en poudre (Sigma) 25 ml de tampon PN (recette ci-dessus) Mélanger pendant 15-20 min en remuant constamment. Faites tourner 2 fois à 400 xg pendant 10 min. Utiliser le surnageant, et assurez-vous de ne pas déranger les protéines du lait précipités.