Høy effektivitet, stedsspesifikk Transfeksjon av tilhenger Celler med siRNA Bruke microelectrode Arrays (MEA)

Summary

Artikkelen detaljer protokollen for stedsspesifikk transfeksjon av kryptert sekvens av siRNA i en tilhenger pattedyrcelle kultur ved hjelp av en microelectrode array (MEA).

Abstract

Oppdagelsen av RNAi vei i eukaryoter og den påfølgende utvikling av RNAi agenter, for eksempel siRNA og shRNA, har oppnådd en potent metode for stanse spesifikke gener ^1-8 for funksjonell genomforskning og terapi. En stor utfordring i RNAi baserte studier er levering av RNAi midler til målrettede celler. Tradisjonelle ikke-virale levering teknikker som bulk elektroporering og kjemiske transfeksjon metodene ofte mangler den nødvendige romlige kontroll over produksjonstid og råd fattige transfeksjon effektivitet ^9-12. Nylige fremskritt i kjemiske transfeksjon metoder som kationiske lipider, kationiske polymerer og nanopartikler har resultert i svært forbedret transfeksjon effektivitet ^13. Men disse teknikkene fortsatt ikke klarer å tilby nøyaktig romlig kontroll over levering som kan umåtelig nytte miniatyrisert høy gjennomstrømming teknologier, encellede studier og undersøkelser av celle-celle interaksjoner.

nt "> Nyere teknologiske fremskritt innen genet levering har aktivert high-throughput transfeksjon av tilhenger celler ^14-23, et flertall av dem bruker mikroskala electroporation. mikroskala electroporation gir presis spatio-temporal kontroll over levering (opp til enkeltceller), og har vist for å oppnå høy effektivitet ^{19, 24-26.} I tillegg gjør electroporation tilnærminger ikke krever en lengre inkubasjonstid (vanligvis 4 timer) med siRNA og DNA komplekser som nødvendig i kjemiske basert transfeksjon metoder og føre til direkte inntasting av naken siRNA og DNA molekyler i cellen cytoplasma. Som en konsekvens genuttrykk kan oppnås så tidlig som seks timer etter transfeksjon ^27. Vår lab har tidligere demonstrert bruk av mikroelektroden arrays (MEA) for stedsspesifikk transfeksjon i adherente pattedyr cellekulturer ^17-19. I MEA tilnærming, er levering av genetisk nyttelast oppnås via lokalisert mikro-skala electroporatipå av celler. En anvendelse av elektrisk puls til utvalgte elektroder genererer lokal elektrisk felt som fører til elektroporering av celler tilstede i regionen av de stimulerte elektroder. Den uavhengige styring av mikro-elektrodene gir romlige og tidsmessige kontroll over transfeksjon og også gjør at flere transfeksjon baserte forsøk som skal utføres på den samme kulturen øke eksperimentelle gjennomstrømming og redusere kultur til kultur variabilitet.

Her beskriver vi den eksperimentelle oppsett og protokollen for målrettet transfeksjon av adherente HeLa celler med en fluorescently merket kryptert sekvens siRNA med electroporation. Samme protokoll kan også brukes for transfeksjon av plasmidvektorer. Tillegg kan protokollen beskrevet her enkelt kan utvides til en rekke pattedyr cellelinjer med mindre modifikasjoner. Kommersielt tilgjengelig MEAs med både forhåndsdefinerte og egendefinerte elektrodemønstrene gjøre denne teknikken tilgjengelig to fleste forskningslaboratorier med grunnleggende cellekultur utstyr.

Protocol

1. MEA Forberedelse MEAs for bruk i electroporation eksperimenter kan enten være fabrikkert ved hjelp av standard fotolitografi teknikk som beskrevet tidligere 18 eller kjøpes direkte fra leverandørene av MEA produsenter som flerkanals Systems (http:/www.multichannelsystems.com/) og Alpha MED Scientific, Inc. ( http://www.MED64.com) . Den MEAs brukes i våre eksperimenter ble fabr…

Discussion

I denne videoen artikkelen viser vi bruken av MEA for stedsspesifikk transfeksjon av HeLa celler med kryptert sekvens av siRNA. En av fordelene med denne teknologien er dens anvendbarhet til forskjellige cellelinjer inkludert primære cellelinjer. Vår lab har tidligere demonstrert bruk av denne teknologien for stedsspesifikk transfeksjon av primær hippocampus neuronal kultur fra E18 dag gamle rotte og NIH-3T3 celler med eggerøre siRNA sekvenser og GFP plasmid ^{18, 19.} Vi har også hatt suksess i å levere f…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Cell media: Advanced MEM L-Glutamine 200 mM Penicillin/Streptomycin Fetal bovine serum	Gibco/Invitrogen Himedia Laboratories/VWR Lonza group Ltd. Gibco/Invitrogen	12492-013 95057-448 09-757F 16000-044	Cell media composition: 2% FBS, 2%L-glutamine and 2% Pennstrep in Advance MEM
Trypsin EDTA	Mediatech, Inc.	25-053-CL
PBS	Mediatech, Inc.	21-040-CV
Alexa 488 and rhodamine tagged scrambled sequence siRNA	Qiagen, Inc.	1027292
Electroporation buffer	Biorad Laboratories	165-2677
Waveform generator	Pragmatic	2414A	Any waveform/pulse generator that can deliver the desired pulses can be used.