Fremstillingen af akutte hjerneskiver fra isolerede hippocampi samt de samtidige elektrofysiologiske optagelser af astrocytter og neuroner i<em> Stratum radiatum</em> Under stimulering af Schaffer sikkerhedsstillelse beskrives. Den farmakologiske isolering af astroglial kalium og glutamat transportproteiner strømninger er blevet demonstreret.
Astrocytter danner sammen med neuroner treparts synapser, hvor de integrerer og modulerer neuronal aktivitet. Faktisk astrocytter fornemmer neuronale input gennem aktivering af deres ionkanaler og neurotransmitterreceptorer, og bearbejde information dels gennem aktivitet-afhængig frigivelse af gliotransmitters. Endvidere astrocytter udgør det vigtigste optagelsessystem for glutamat, bidrager til kalium rumlig bufferlagring, samt GABA clearance. Disse celler derfor hele tiden overvåge synaptisk aktivitet, og dermed er følsomme indikatorer for ændringer i synaptisk udgivet glutamat, GABA og ekstracellulære kalium niveauer. Derudover kan ændringer i astroglial optagelse aktivitet eller bufferkapacitet har alvorlige virkninger på neuronale funktioner, og kan blive overset, når kendetegnende fysiopatologiske situationer eller knockout mus. Dobbelt optagelse af neuronale og astroglial aktiviteter er derfor en vigtig metode til at studere ændringer isynaptisk styrke af at dermed forbundne ændring af astroglial optagelse og buffermidler kapacitet. Her beskriver vi, hvordan du forbereder hippocampusskiver, hvordan man identificerer stratum radiatum astrocytter, og hvordan du optager samtidigt neuronale og astroglial elektrofysiologiske svar. Desuden beskriver vi, hvordan du isolerer farmakologisk de synaptisk-fremkaldte astrogliale strømme.
Dobbelttællinger af synaptisk-induceret neuronal og glial respons er en nyttig metode til at studere online ændringer i præ-og postsynaptiske aktiviteter associeret med ændringer i astrogliale egenskaber. Den synaptisk-fremkaldte glial membrandepolarisering er et direkte mål for det ekstracellulære kalium stigning 8, dels på grund af præsynaptisk virkningspotentiale fyring, men hovedsagelig til postsynaptiske depolarisering 7. Derfor optagelser af gliale membranpotentiale dynamik kan anvendes til at undersøge ændringer i præsynaptiske excitabilitet, postsynaptisk aktivitet, ekstracellulære rum volumen og kalium buffermidler kapacitet 6, 8. Den astroglial glutamat transportør strøm er et følsomt mål for præsynaptisk glutamatfrigivelse, kunne overvåge kortsigtede ændringer i release sandsynlighed 3, 5, 9. Det kan endvidere anvendes til at karakterisere de funktionelle synapse-glia interaktioner på forskellige synapser eller på forskellige udviklingsstadier staldre 10. Det bør fremhæves, at GLTs er meget temperaturfølsomme 11 og er drevet af den elektrokemiske gradient af Na +, K + og H +12. Således amplituden og kinetik af GLT strøm stærkt afhængig af de valgte forsøgsbetingelser. Endvidere er den faktiske tidsforløbet af astroglial glutamat clearance afledt fra den indspillede GLT strøm kendt for at være delvist skjult. Dette skyldes filtrering af GLT strømme af faktorer, såsom de electrotonic egenskaber af astrocytter eller det asynkrone transmitterfrigivelse, som forvrider deres kinetik 13. Fremgangsmåder udvinder de tidsmæssige forhold i filtreringsmekanismer er blevet udviklet og kan anvendes til at udlede den aktuelle glutamat clearance tidsforløb i fysiologiske eller patologiske situationer, som recenly udført 6,13,14. Derudover samtidig optagelse af astroglial membrandepolarisering i strømtang, kan give insignifikantHTS af mulige ændringer af ekstracellulære kalium transienter. Enkelte astrocytter kontakt op til 100.000 synapser på ~ 100 forskellige neuroner, og lad derfor integrere og modulerer aktiviteten af lokale neurale netværk.
Når du bruger den teknik, der præsenteres her, dvs optagelse elektrofysiologiske hel-celle responser fra astrocytter at få indblik i basal synaptisk aktivitet, bør man huske på, at i astrocytter, patch-clamp optagelser på soma-niveau muligt at konstatere strømme hovedsagelig stammer fra cellen soma eller proksimale processer. Faktisk strømme detekteres ved soma kun delvis stamme fra fine distale processer, når en stærk aktivering af receptorer og kanaler der forekommer i flere fine processer kan generere strømme udbreder sig til den celle soma. Således basal receptoren og kanalaktivitet i individuelle små astrogliale processer omfatter synaptiske rum næppe detekterbar. Dette skyldes til dels begrænsede yngelial og tidsmæssig kontrol af membran strømme og spændinger ved hel-celle patch-clamp optagelser fra astrocytter in situ. Imidlertid skal det bemærkes, at overfladen af de rigelige små astrocytiske processer langt overstiger membranarealet af soma og vigtigste processer. Desuden indeholder disse perisynaptic astrogliale mikrodomæner de funktionelt relevante receptorer og kanaler, hvilket sandsynligvis spiller en vigtig rolle i neuroglial kommunikation og synaptiske regulering. Den teknik, som vi præsenterede her er derfor mest hensigtsmæssigt at undersøge astrocytisk integration af synkron aktivitet fra neuronale ensembler, der forekommer især i afference stimulation. Det bør ikke bruges til at studere dialogen mellem de enkelte synapser og tilstødende fine astrocytiske processer, der opstår under basal spontan aktivitet. En alternativ fremgangsmåde til at studere lokale astrogliale responser induceret af basal synaptisk aktivitet ville være at udføre patch-clamp-optagelser af fine processer, som den i dendritter 15. Selvom lappe disse fine astrogliale processer sandsynligvis er udfordrende på grund af deres lille størrelse, er det sandsynligvis en avenue til at forfølge at trævle mere intime dialog mellem astrogliale mikrodomæner og individuelle synapser. Dog kan de sandsynlige små elektrofysiologiske astrogliale reaktioner som følge af de enkelte fine astrogliale processer være under tærskelværdien afsløring, da elektrisk støj når i gennemsnit 3-5 pA i patch-clamp optagelser. En anden fremgangsmåde til at studere astrogliale reaktioner på synaptisk aktivitet er calcium imaging, idet aktivering af astrocytiske membranreceptorer eller transportører af neuroaktive stoffer kan udløse intracellulært calcium transienter. Dog kan isætning af astrocytter med calcium indikatorer også afspejler hovedsagelig somatisk aktivitet 16. Kombinationen af elektrofysiologi og calcium imaging også muligt detektere små calcium signaler fra fine astrogliale processer, enten forekommende spontant eller udløses by minimal synaptisk stimulation 17, 18. Man skal dog huske på, at høj affinitet calcium indikatorer kan fungere som calcium buffere, hæmmer vigtige calcium signaleringsveje, hvorimod lav-affinitet indikatorer kan arbejde under detektionsniveauet. Endelig er en elegant og ikke-invasiv teknik til at undersøge calcium begivenheder i fine astrocytiske processer, som også omgår udvaskning af intracellulære signalmolekyler ved helcelle-patch-clamp, består i anvendelse af en membran målrettet calcium sensor, som kan udtrykkes i astrocytter in situ. såvel som in vivo 19 Dog kan calcium imaging kun give oplysninger om en signalmolekyle, som er involveret i mange, men ikke alle cellulære aktiviteter, mens hel-celle patch-clamp giver kvantitative oplysninger om alle de forskellige ionstrømme udløses ved kanal og receptor-aktivering. Derfor samtidige elektrofysiologiske optagelser fra neuroner og astrocytterer en unik og stærk metode til at udrede online dynamikken i neuroglial ionisk signalering og dets rolle hjerne informationsbehandling.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Dana Kamalidenova, Morgan Autexier, og Roch Chopier, der gjorde video og animationer, samt Florian Beck for fotografier og post-produktion af video voice-over. Dette arbejde blev sponsoreret af Olympus og støttet af tilskud fra HFSPO (Career Development Award), ANR (Programme Jeunes chercheurs og Programme Blanc Neurosciences), FRC (Fédération pour la Recherche sur le Cerveau), INSERM og La Pitié Salpêtrière hospital (Translationel forskning kontrakt) til NR, fra fransk Research ministeriet og Deutsche Forschungsgemeinschaft postdoc stipendier til UP, og fra de ph.d.-skole "Frontiers in Life Science", Paris Diderot University, Bettencourt Schuller fundament, og FRM (Fondation pour la Recherche MEDICALE) ph.d.-stipendium til JS
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Picrotoxin | Sigma | P1675 | dissolve in DMSO |
Kynurenic Acid | Tocris | 0223 | dissolve at 34 °C stirring or sonication |
DL-TBOA | Tocris | 1223 | DCG IV Tocris 0975 |