La preparación de cortes de cerebro de agudos de hipocampo aislado, así como los registros simultáneos electrofisiológicas de los astrocitos y las neuronas en<em> Estrato radiado</em> Durante la estimulación de Schaffer colaterales se describe. El aislamiento farmacológico de potasio astroglial y corrientes transportador de glutamato se demuestra.
Los astrocitos forman junto con las sinapsis neuronas tripartitos, donde se integran y modulan la actividad neuronal. De hecho, los astrocitos detectar entradas neuronales a través de la activación de los canales iónicos y receptores de neurotransmisores y procesar información, en parte, a través de la actividad dependiente de la liberación de gliotransmitters. Además, los astrocitos constituyen el sistema de captación principal para el glutamato, contribuir a tamponamiento espacial de potasio, así como el aclaramiento de GABA. Estas células tanto, un seguimiento constante de la actividad sináptica y, por lo tanto, son indicadores sensibles de las alteraciones en el glutamato sinápticamente-lanzado, los niveles de GABA y potasio extracelular. Además, las alteraciones en la actividad de captación astroglial o capacidad tampón puede tener efectos graves en las funciones neuronales, y podría pasar por alto la hora de caracterizar situaciones fisiopatológicas o ratones knock-out. Grabación Dual de actividad neuronal y astroglial tanto, es un método importante para estudiar las alteraciones enla fuerza sináptica asociada a los cambios concomitantes en la absorción y la capacidad de tamponamiento astroglial. Aquí se describe cómo preparar cortes de hipocampo, la forma de identificar estrato astrocitos radiatum, y cómo registrar las respuestas electrofisiológicas simultáneamente neuronal y astroglial. Por otra parte, se describe cómo aislar las corrientes farmacológicamente sinápticamente evocados astroglial.
Grabación dual de sinápticamente indujo respuestas neuronales y gliales es un método útil para estudiar las alteraciones en línea en las actividades de pre-y postsinápticos asociados a cambios en las propiedades astrogliales. La despolarización evocada sinápticamente membrana glial es una medida directa del aumento de potasio extracelular 8, debido en parte a la cocción presináptica potencial de acción, pero sobre todo a la despolarización postsináptica 7. Por lo tanto grabaciones de gliales dinámica del potencial de membrana se puede utilizar para investigar modificaciones en la excitabilidad presináptico, actividad postsináptica, volumen de espacio extracelular y la capacidad de tamponamiento de potasio 6, 8. La corriente transportador de glutamato astroglial es una medida sensible de la liberación de glutamato presináptico, capaz de monitorear cambios a corto plazo en la probabilidad de liberación 3, 5, 9. Además, puede ser utilizado para caracterizar las sinapsis funcionales glia-interacciones en las sinapsis diferentes o en st desarrollo diferentemayores de 10 años. Se debe destacar que GLTs son altamente sensibles a la temperatura 11 y son accionados por el gradiente electroquímico de Na +, K + y H +12. Así, la amplitud y cinética de la corriente GLT depende altamente de las condiciones experimentales elegidas. Además, el curso de tiempo real de aclaramiento de glutamato astroglial derivada de la corriente GLT grabada se sabe que está parcialmente oculta. Esto se debe a que el filtrado de las corrientes de GLT por factores tales como las propiedades electrotonic de astrocitos o la liberación del transmisor asíncrono, que distorsionan sus cinéticas 13. Métodos de extracción de las características temporales de los mecanismos de filtrado se han desarrollado y se pueden utilizar para derivar la distancia real de glutamato curso temporal en situaciones fisiológicas o patológicas, como recenly realiza 6,13,14. Además, la grabación simultánea de la despolarización de la membrana astroglial, en la pinza de corriente, puede proporcionar INSIGhts a posibles alteraciones del potasio extracelular transitorios. Astrocitos individuales contacto de hasta 100.000 sinapsis de ~ 100 neuronas diferentes, y por lo tanto se integran y modular la actividad de redes neuronales locales.
Cuando se utiliza la técnica que aquí se presentan, es decir, registro electrofisiológico de células enteras respuestas de los astrocitos para obtener información sobre la actividad sináptica basal, hay que tener en cuenta que en los astrocitos, patch-clamp grabaciones a nivel soma permitir la detección de corrientes en su mayoría procedentes del soma celular o procesos proximales. De hecho, las corrientes detectadas en el soma sólo parcialmente se originan a partir de finos procesos distales cuando una fuerte activación de receptores y canales que ocurren en múltiples procesos finos puede generar corrientes se propagan hacia el soma celular. Así receptor basal y la actividad del canal en los procesos individuales de pequeños compartimentos que cubren astrogliales sinápticas es difícilmente detectable. Esto es debido en parte a la limitada semillaial de control y temporal de las corrientes y tensiones de la membrana de células enteras patch-clamp grabaciones de los astrocitos in situ. Sin embargo, hay que señalar que la superficie de los abundantes procesos astrocíticos diminutas excede con mucho el área de la membrana de los procesos de soma y principal. Además, estos microdominios astrogliales perisynaptic contienen los receptores funcionalmente relevantes y los canales, los cuales probablemente juegan un papel importante en la comunicación neuroglial y regulación sináptica. La técnica que se presenta aquí es por lo tanto sobre todo útil para estudiar la integración astrocytic de actividad sincrónica de conjuntos neuronales, que se producen en particular durante la estimulación aferencia. No debe ser utilizado para estudiar el diálogo entre las sinapsis individuales y adyacentes procesos astrocíticos finas que se producen durante la actividad espontánea basal. Un método alternativo para estudiar las respuestas locales astrogliales inducida por la actividad sináptica basal sería realizar patch-clamp grabaciones de procesos finos, como duno en dendritas 15. Aunque estos procesos astrogliales parches finos es probablemente un reto debido a su pequeño tamaño, es probable que sea una vía que debe seguirse para desentrañar diálogo más estrecho entre microdominios astrogliales y sinapsis individuales. Sin embargo, las probabilidades pequeñas respuestas electrofisiológicas astrogliales resultantes de los procesos individuales de astrogliales finas pueden estar por debajo del umbral de detección, ya que el ruido eléctrico alcanza en promedio 5.3 pA en patch-clamp grabaciones. Otro método para estudiar las respuestas astrogliales a la actividad sináptica es imagen de calcio, ya que la activación de receptores de membrana astrocíticos o transportadores de sustancias neuroactivas puede desencadenar los transitorios de calcio intracelular. Sin embargo, la carga masiva de los astrocitos con indicadores de calcio también puede reflejar principalmente la actividad somática 16. La combinación de imágenes de electrofisiología y calcio también permite detectar pequeñas señales de calcio a partir de los procesos de astrogliales finas, ya sea de forma espontánea o disparada by un mínimo de estimulación sináptica 17, 18. Sin embargo, hay que tener en cuenta que la alta afinidad indicadores calcio podrían actuar como amortiguadores de calcio, inhibidores de las vías de señalización importantes de calcio, mientras que la baja afinidad indicadores pueden trabajar por debajo del nivel de detección. Finalmente, una técnica elegante y no invasivo para estudiar eventos de calcio en finas procesos astrocíticos, que también evita el lavado de moléculas de señalización intracelular durante su conjunto de células patch-clamp, consiste en utilizar una membrana dirigida sensor de calcio, que puede expresarse en astrocitos in situ, así como in vivo 19. Sin embargo, imágenes de calcio sólo puede proporcionar información acerca de molécula de señalización uno, que está implicado en muchas, pero no todas las actividades celulares, mientras que su conjunto de células patch-clamp proporciona información cuantitativa acerca de todas las diferentes corrientes iónicas activadas en canal y activación del receptor. Por lo tanto, los registros electrofisiológicos simultáneas de neuronas y astrocitosson un método único y de gran alcance para desentrañar la dinámica de la línea de señalización neuroglial iónico y su procesamiento cerebral papel de información.
The authors have nothing to disclose.
Los autores desean agradecer a Dana Kamalidenova, Autexier Morgan, y Chopier Roch, quien hizo el video y animaciones, así como Florian Beck para las fotografías y la post-producción del video voz en off. Este trabajo ha sido patrocinado por Olympus y apoyado por becas de la HFSPO (Premio de desarrollo profesional), ANR (Programa Jóvenes y el Programa chercheurs Blanc Neurosciences), FRC (Fédération pour la Recherche sur le Cerveau), el INSERM y La Pitié Salpêtrière hospital (investigación traslacional contrato) a NR, del Ministerio francés de Investigación y Deutsche Forschungsgemeinschaft becas postdoctorales para arriba, y de las escuelas de doctorado "Fronteras de la Ciencia de la Vida", Universidad Paris Diderot, Bettencourt Schuller fundación, y FRM (Fondation pour la Recherche Medicale) de becas de doctorado para JS
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Picrotoxin | Sigma | P1675 | dissolve in DMSO |
Kynurenic Acid | Tocris | 0223 | dissolve at 34 °C stirring or sonication |
DL-TBOA | Tocris | 1223 | DCG IV Tocris 0975 |