Isolamento di fibroblasti normali e tumorali associata da tessuti freschi di fluorescenza activated cell sorting (FACS)
Summary
Cancro fibroblasti associati (CAF) facilitare l'iniziazione del tumore, la crescita e la progressione attraverso la segnalazione che promuove la proliferazione, l'angiogenesi, e l'infiammazione. Qui si descrive un metodo per isolare popolazioni pure di fibroblasti normali e CAF dal topo freschi e tessuti umani mediante selezione delle cellule, utilizzando PDGFRα come marcatore di superficie.
Abstract
Cancro-associate fibroblasti (CAF) sono il tipo cellulare più prominente nello stroma del tumore di molti tumori, in particolare carcinoma mammario, e la loro presenza prominente è spesso associato con 1,2 prognosi. CAF sono una sottopopolazione di fibroblasti attivati stromali, molti dei quali esprimono il marcatore myofibroblast α-SMA 3. CAF provengono da fibroblasti tissutali locali nonché da midollo osseo, cellule reclutati nel tumore sviluppare e adottare un fenotipo CAF sotto l'influenza del microambiente tumorale 4. CAF sono stati dimostrato di facilitare l'iniziazione del tumore, la crescita e la progressione attraverso la segnalazione che promuove la proliferazione delle cellule tumorali, l'angiogenesi e l'invasione 5-8. Abbiamo dimostrato che i CAF migliorare la crescita tumorale di mediazione che promuove l'infiammazione del tumore, a partire al più presto pre-neoplastiche stadi 9. Nonostante la crescente evidenza dei CAF ruolo chiave svolgere nel facilitare la crescita tumorale,CAF studiano è una continua sfida a causa della mancanza di CAF-specifici marcatori e l'eterogeneità parte di queste cellule, con molti sottotipi coesistenti nel microambiente tumorale 10. Inoltre, studiando fibroblasti in vitro è ostacolato dal fatto che il loro profilo di espressione genica è spesso alterato in coltura tissutale 11,12. Per risolvere questo problema e per consentire imparziale profilo di espressione genica di fibroblasti di topo fresco e tessuti umani, abbiamo sviluppato un metodo basato sui protocolli precedenti per fluorescenza selezione delle cellule attivate (FACS) 13,14. Il nostro approccio si basa su utilizzando PDGFRα come marcatore di superficie per isolare i fibroblasti di topo freschi e tessuti umani. PDGFRα è abbondantemente espresso da entrambi i fibroblasti normali e CAF 9,15. Questo metodo permette di isolare popolazioni pure di fibroblasti normali e CAF, tra cui, ma non limitato a α-SMA + attivato miofibroblasti. Fibroblasti isolati possono quindi essereutilizzati per la caratterizzazione e confronto dell'evoluzione di espressione genica che si verifica nei CAFS durante la tumorigenesi. In effetti, noi e gli altri segnalati profilo di espressione di fibroblasti isolati da cellule ordinamento 16. Questo protocollo è stato eseguito con successo per isolare e creare un profilo popolazioni altamente arricchito di fibroblasti dai tessuti della pelle, della mammella, del pancreas e del polmone. Inoltre, il nostro metodo permette anche di coltura delle cellule filtrate, per eseguire esperimenti funzionali e per evitare contaminazione da cellule tumorali, che spesso è un grosso ostacolo quando si cerca di CAF cultura.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mentre esperimenti condotti in coltura tissutale può essere informativo e suggerire principi funzionali che possono essere verificati in vivo, è noto che si verificano grandi cambiamenti nell'espressione genica di cellule in coltura 11,12. Per evitare un passo coltura tissutale a profilare espressione genica in fibroblasti, abbiamo sviluppato un protocollo che permette di isolare normali, così come cancro-associate fibroblasti di topo freschi o tessuti umani. Questo protocollo è stato applica…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Dott. Yitzchak Oschry e il Dr. Orit Sagi-Asif per il loro aiuto con la selezione FACS. Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni a NE del programma europeo per il Settimo programma quadro dell'Unione (FP7/2007-2013) nell'ambito della convenzione di sovvenzione n ° [276890], da Israele Cancer Association (# 20110078), e da Israele Cancer Research Fund (Ricerca Career Development Award).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| DMEM | Gibco | 41965 | |
| PBS | Biological Industries | 02-023-1A | |
| Collagenase II | Worthington | LS4176 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS4188 | |
| Deoxyribonuclease | Worthington | LS2007 | |
| PharmLyse | BD | 555899 | |
| Cell strainer 70 μm | SPL | 93070 | |
| Purified anti-mouse CD16/CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
| Via probe (7AAD) | e-Bioscience | 00-6993-50 | |
| Anti-mouse CD140a-PE (PDGFRa) | e-Bioscience | 12-1401-81 | |
| Anti-mouse F4/80- FITC | Cederlane | CL8940F | |
| DMEM w/o Phenol Red | Gibco | 31053 | |
| Collagen Type I | BD Biosciences | 354236 |
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