Una lettura molecolare di lungo termine adattamento olfattivo nel<em> C. elegans</em
Summary
Qui descriviamo una lettura molecolare di lungo termine dell'adattamento olfattivo<em> Caenorhabditis elegans</em>. La proteina chinasi G, EGL-4, è necessario per le risposte di adattamento stabili nella coppia primaria neurone sensoriale chiamato AWC. Durante prolungati odore di esposizione EGL-4 trasloca dal citosol al nucleo della AWC.
Abstract
Durante la stimolazione prolungata più neuroni sensoriali si adatterà la loro risposta diminuendo la loro sensibilità al segnale. La risposta di adattamento aiuta attenzione la forma e protegge anche le cellule provenienti da oltre-stimolazione. Adattamento nel circuito olfattivo di C. elegans è stato descritto da Colbert e Bargmann 1,2. Qui, gli autori hanno definito i parametri del paradigma adattamento olfattivo, che hanno usato per la progettazione di uno screening genetico di isolare mutanti difettosi nella loro capacità di adattarsi agli odori volatili rilevati dalle Amphid cellule alari di tipo C (AWC) neuroni sensoriali. Quando tipo selvatico C. elegans animali sono esposti a un interessante AWC-sentito odore 3 per 30 minuti che si adatterà la rispondenza alle l'odore e quindi ignorare l'odore adattando in un saggio di chemiotassi comportamentale per ~ 1 ora. Quando tipo selvatico C. elegans animali sono esposti a un interessante AWC-sentito odore di ~ 1 ora saranno quindi ignorare l'odore di adattare di achemotaxis test comportamentali per circa 3 ore. Queste due fasi di adattamento olfattivo in C. elegans sono stati descritti come breve termine l'adattamento olfattivo (indotta dopo 30 minuti di esposizione odore), ea lungo termine adattamento olfattivo (indotto dopo 60 minuti di esposizione odore). Più tardi lavorare da L'Etoile et al., 4 scoperto una proteina chinasi G (PKG) chiamato EGL-4 che è necessario sia per l'adattamento a breve e lungo termine nei neuroni olfattivo AWC. Il-4 EGL proteina contiene una sequenza di localizzazione nucleare che è necessario a lungo termine risposte di adattamento olfattive, ma non indispensabili per il breve termine, le risposte di adattamento olfattivo nel AWC 4. Taggando EGL-4 con una proteina fluorescente verde, è stato possibile visualizzare la localizzazione di EGL-4 nel AWC durante l'esposizione prolungata odore. L'utilizzo di questo completamente funzionale GFP-tagged EGL-4 (GFP :: EGL-4) molecola siamo stati in grado di sviluppare una lettura molecolare di lungo termine adattamento olfattivo nel AWC 5. Utilizzando questo mlettura olecular di adattamento olfattivo siamo stati in grado di eseguire entrambi gli schermi in avanti e all'indietro genetici per identificare gli animali mutanti che presentano i modelli difettosi localizzazione subcellulare di GFP :: EGL-4 nel AWC 6,7. Qui si descrive: 1) la costruzione di GFP :: EGL-4 animali che esprimono, 2) il protocollo per la coltivazione di animali a lungo termine saggi traslocazione odore indotta nucleari, e 3) il punteggio di lungo termine odore indotta traslocazione evento nucleare e il recupero (ri-sensibilizzazione) dal nucleare GFP :: EGL-4 Stato.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'odore indotta ingresso nucleare di GFP-tagged EGL-4 molecola qui descritta fornisce una lettura solida molecolare di adattamento olfattivo in C. elegans. L'odore indotte saggi traslocazione nucleare sono semplici e richiedono solo pochi giorni di tempo di preparazione. Il pyIs500 animale che abbiamo costruito per questi test, esprime un marcatore che illumina il neurone AWC oltre ad esprimere la GFP-tagged EGL-4 proteine. Pertanto, riteniamo che uno sperimentatore con poca o nessuna esperienz…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare Scott Hamilton, ed i membri del laboratorio di O'Halloran per la lettura attenta di questo manoscritto. Ringraziamo anche il nostro anonimo recensore per eccellenti suggerimenti e commenti penetranti.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Bacto Agar | Difco | DF0140-07-4 | NGM plates |
| Sodium Chloride | Fisher Chemical | S671-10 | NGM plates |
| Bacto Peptone | Difco | DF0118-07-2 | NGM plates |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Chemical | S375-500 | S-Basal buffer and NGM plates |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Chemical | P285-500 | S-Basal buffer and NGM plates |
| Kimwipes – Small | Kimberly-Clark | LS2770 | |
| Ethanol 100% | Gold Shield Chemical Co. | 43196-115 | diluting odors for chemotaxis assays |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C8106-500G | NGM plates |
| Magnesium Sulphate | MP Biomedicals | 150136-500G | NGM plates |
| Sodium Azide 99% | Fisher Scientific | ICN10289180 | Anesthetic |
| Agarose – UltraPure | Invitrogen | 16500-500 | Agarose pads |
| Benzaldehyde | Sigma-Aldrich | B1334-100G | AWC odor |
| Butanone, ACS Grade | Sigma-Aldrich | 360473-500ML | AWC odor |
| Microcentrifuge Tubes – 1.5 ml Colored | Denville | LS8147 | |
| Pasteur Pipet Disposable Glass 5-3/4″ | Fisher Scientific | 13-678-20B | |
| Stratalinker | Stratagene | Stratalinker 2400 | UV integration |
| Filter Vacuum Bottle – 500 ml | Nalgene | 09-740-25B |
References
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