Imaging Analyse van de Neuron tot Glia Interactie in Microfluïdische Cultuur Platform (MCP)-gebaseerde Neuronale Axon en Glia Co-cultuur systeem

Summary

Deze studie beschrijft de procedures van het opzetten van een nieuwe neuronale axon en (astro) glia co-cultuur platform. In deze co-cultuur systeem, manipulatie van directe interactie tussen een axon (en single gliale cel) wordt het mogelijk, waardoor mechanistische analyse van de wederzijdse neuron naar gliale signalering.

Abstract

Proper neuron glia interactie is essentieel om fysiologische functie van het centrale zenuwstelsel (CNS). Deze bi-directionele communicatie wordt sophisticatedly gemedieerd door specifieke signaalwegen tussen neuron en glia ^1,2. Identificatie en karakterisering van deze signaalroutes is essentieel voor het begrijpen hoe neuron glia interactie vormen CNS fysiologie. Eerder hebben neuron en glia gemengde kweken op grote schaal gebruikt voor het testen en karakteriseren signaalwegen tussen neuronen en glia. Wat we geleerd van deze preparaten en andere in vivo gereedschap heeft echter gesuggereerd dat onderlinge signalering tussen neuronen en glia vaak voor in specifieke compartimenten in neuronen (bijvoorbeeld axon, dendriet of soma) ^3. Dit maakt het belangrijk om de ontwikkeling van een nieuwe cultuur systeem dat scheiding van neuronale compartimenten maakt en in het bijzonder onderzoekt de interactie tussen glia en neurointerne axonen / dendrieten. Bovendien is de conventionele mengcultuur systeem niet kunnen differentiëren de oplosbare factoren en direct contact membraan signalen tussen neuronen en glia. Bovendien is de grote hoeveelheid neuronen en gliacellen in de conventionele co-cultuur ontbreekt het de resolutie nodig is om de interactie tussen een axon en een gliacel observeren.

In deze studie beschrijven we een nieuwe axon en glia co-cultuur systeem met behulp van een microfluïdisch platform cultuur (MCP). In dit co-cultuur systeem worden neuronen en gliale cellen gekweekt in aparte kamers die zijn verbonden via meerdere centrale kanalen. In deze microfluïdische cultuur platform, alleen neuronale processen (met name axonen) kan de gliale kant binnenkomen via de centrale kanalen. In combinatie met krachtige fluorescerend eiwit labeling, dit systeem rechtstreeks onderzoek van signaalroutes tussen axonale / dendritische en gliale interacties dergelijkes axon-gemedieerde transcriptionele regulatie in glia, glia-gemedieerde receptor handel in neuronale terminals, en glia-gemedieerde axon groei. De smalle diameter van de kamer ook significant verbiedt de stroom van de neuron verrijkte medium in de kamer gliale, vergemakkelijken sondering van de direct membraan-eiwit interactie tussen axonen / dendrieten en gliale oppervlakken.

Protocol

1. Vergadering van de Microfluïdische Cultuur Kamer (MCP) MCP (figuur 1) zijn ontworpen voor open kamers compartimenten culturen van verschillende soorten cellen 4. Het heeft meestal twee compartimenten die zijn verbonden via het centrale kanaal (3 urn in diameter). Montage van MCP met glazen bodem gerechten is noodzakelijk voor het bereiden van culturen en de daaropvolgende beeldvorming analyse. Eerste laag steriele glazen bodem gerechten met polyornithine (Sigma-Aldric…

Representative Results

Time-lapse imaging analyse van axon-geïnduceerde GLT1 promotor activering in astrocyten De compartimenten neuron en astrocyt co-cultuur systeem slechts de neuronale processen, vooral de axonen, selectief interactie met astrocyten. Na de succesvolle oprichting van axon en astrocyten (of andere gliacellen) co-cultuur in de gemonteerde MCP, kan verschillende types van axon-glia interacties worden bestudeerd, zoals; axon-geïnduceerde activatie van astrogliale gen promoter activering, astrocyten-g…

Discussion

De MCP based neuron en astrocyten co-cultuur systeem maakt dissectie gedetailleerde neuron astroglia signaalwegen door alleen de axons langs de centrale kanalen en interactie met de astrogliale cellen. Deze co-cultuur systeem kan eenvoudig worden ingesteld met conventionele neuron en astrocyte cultuur procedures. We hebben ook beschreef een praktische toepassing van deze co-cultuur systeem door het gebruik van een eGFP gebaseerde reporter voor het aantonen van axon-afhankelijke GLT1 promotor activering in astrocyten. </…

Materials

Fetal bovine serum	Hyclone	SH30070.03	for plating neuron for neuron cutlure medium
Fetal bovine serum	Sigma-Aldrich	F4135	for astrocyte culture medium
Glial derived nerve factor	R&D systems	212-GD	Apply 10-20 ng/ml to neuron side of chamber
Dulbecco modified eagle medium high glucose	Sigma-Aldrich	11995
70 mm cell strainer	BD Falcon	352350
Sterile glass bottom dish	MatTek Corporation
Microfluidic culture platforms	Xona Microfluidics LLC	SND150
6 wells of the culture plate	Cellstar	657 160
			Neuron culture medium Neurobasal medium 2% B27 Neurobasal supplement 2 mM glutamate by adding 1% 100x GlutaMAX 1% Penicillin-streptomysin
			Neuron culture medium for plating cell Neurobasal medium 2% B27 Neurobasal supplement 2 mM glutamate by adding 1% 100x GlutaMAX 1% Penicillin-streptomysin 5% Fetal bovine serum SH30070.03
			Astrocyte culture medium Dulbecco modified eagle medium high glucose 10% Fetal bovine serum F4135 1% Penicillin-streptomysin
			Table 1. Materials used in the microfluidic culture platform-based neuronal axon and glia co-culture system.