Studie av DNA Damage Checkpoint med<em> Xenopus</em> Egg Extrakt

Summary

Xenopus ägg extrakt är en användbar modell för att undersöka Checkpoint DNA-skador. Detta protokoll är för beredning av Xenopus ägg extrakt och DNA skador checkpoint reagens inducerande. Dessa tekniker är anpassningsbara till en mängd olika DNA-skadande tillvägagångssätt i studien av DNA-skada kontrollpunkt signalering.

Abstract

På en daglig basis, celler utsätts för en mängd av endogena och miljömässiga förolämpningar. För att bekämpa dessa förolämpningar har celler utvecklats checkpoint DNA-skada signalering som en övervakningsmekanism för att känna DNA-skador och direkta cellulära svar på DNA-skador. Det finns flera grupper av proteiner som kallas sensorer, givare och effektorer involverade i DNA-skador kontrollpunkt signalering (figur 1). I denna komplexa signalväg är ATR (ATM och Rad3-relaterade) ett av de största kinaser som kan svara på DNA-skador och replikering stress. Aktiverad ATR kan fosforylera dess nedströms substrat såsom Chk1 (Checkpoint kinas 1). Därför fosforylerat och aktiverad Chk1 leder till många nedströms effekter i DNA-skador checkpoint, inklusive cellcykelstopp, transkriptionsaktivering, DNA-skador reparation och apoptos eller senescens (figur 1). När DNA skadas, om att aktivera DNA resulterar skada kontrollpunkt i unrepsändes skada och därefter genomisk instabilitet. Studien av DNA-skador kontrollpunkten kommer belysa hur celler upprätthåller genomisk integritet och ge en bättre förståelse för hur mänskliga sjukdomar, såsom cancer, utvecklas.

Xenopus laevis ägg extrakt växer fram som en kraftfull cellfritt extrakt modellsystem i DNA-skador kontrollpunkt forskning. Låg hastighet extrakt (LSE) ursprungligen beskrivs av Masui grupp ^1. Tillsatsen av demembranated spermier kromatin till LSE resulterar i kärnor bildas där DNA replikeras i en semiconservative sätt en gång per cellcykeln.

Den ATR/Chk1-mediated Checkpoint signalväg utlöses av DNA-skada eller replikering stressen ^2. Två metoder används idag för att inducera Checkpoint DNA-skador: DNA-skadande metoder och DNA-skador, härma strukturer ^3. DNA-skada kan induceras genom ultraviolett (UV) strålning, γ-strålning, metyl metanesulfonate (MMS), mitomycin C (MMC), 4-nitrokinolin-1-oxid (4-NQO), eller afidikolin ^{3, 4.} MMS är ett alkyleringsmedel som hämmar DNA-replikation och aktiverar ATR/Chk1-mediated DNA-skada kontrollpunkt ^4-7. UV-strålning utlöser också ATR/Chk1-dependent ^DNA-8 skador kontrollpunkt. Den DNA-skada-imitera strukturen AT70 är en glödgad komplex av två oligonukleotider poly-(dA) 70 och poly-(dT) 70. Det AT70-systemet utvecklades i Bill Dunphy laboratorium och används ofta för att framkalla ATR/Chk1 checkpoint signalering ^9-12.

Här beskriver vi protokoll (1) att förbereda cellfria ägg extrakt (LSE), (2) att behandla Xenopus spermier kromatin med två olika DNA skada metoder (MMS och UV), (3) att förbereda DNA-skador, imitera struktur AT70, och (4) att utlösa ATR/Chk1-mediated kontrollpunkt DNA-skador i LSE med skadad sperma kromatin eller en DNA-skada-imitera strukturen.

Protocol

1. LSE Förberedelse Kvinnliga grodor (Xenopus laevis) injiceras två gånger för insamling av ägg. Den första injektionen (priming) är 100 U PMSG (gravid Mare Serum Gonadotropin) per groda. Grodor måste fyllas minst två dagar innan inducera äggläggning och primade grodor är användbara i upp till två veckor. För prime grodor, injicera PMSG subkutant i den dorsala lymfan säckar med en 3 ml spruta och 27 G nål. För att inducera äggläggning, injicera 500 U hCG (humant koriongo…

Discussion

Det finns flera fördelar med att studera checkpoint DNA-skador med Xenopus ägg extrakt. Användningen av ägg extrakt ger en stor mängd av cellfria extrakt synkroniserade vid interfasen av cellcykeln. De ägg extrakt kan enkelt och billigt göras. Det är relativt lätt att skada DNA eller kromatin och att avslöja en defekt i DNA-skador kontrollpunkt efter immunodepleting ett målprotein från äggextrakt. Därefter kan en potentiell funktion defekt vara "räddas" genom addback av vildtyp eller mu…

Materials

			Reagents
Anti-Chk1 P-S344 antibody	Cell Signaling	2348L
Anti-Chk1 antibody	Santa Cruz	SC7898
Aprotinin	MP Biomedicals	0219115880
Cycloheximide	Sigma	C7698-5G
Cytochalasin B	EMD	250233
Dithiothreitol (DTT)	VWR	JTF780-2
hCG	Sigma	CG10-10VL
L-Cysteine	Sigma	C7352-1KG
Leupeptin	VWR	97063-922
Methyl methanesulfonate (MMS)	Sigma	129925-5G
Nocodazole	Sigma	M1404-2MG
PMSG	Calbiochem	367222
Sample buffer	Sigma	S3401
Tautomycin	Wako Chemicals USA	209-12041
			Equipment
Bucket for egg laying	Rubbermaid commercial products	6308
CL2 IEC centrifuge with swinging bucket rotor	Thermo Scientific	004260F
HB6 swinging bucket rotor	Thermo Scientific	11860
Sorvall RC6 plus superspeed centrifuge	Thermo Scientific	46910
UV crosslinker	UVP	95-0174-01
			Solutions
1x MMR			100 mM NaCl, 2 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 2.5 mM CaCl2, 5 mM HEPES, adjust pH to 7.8 with 10 M NaOH
Aprotinin/Leupeptin stock			10 mg/ml each in water. Store 20 μl aliquots at -80 °C.
Buffer X			0.2 M sucrose, 80 mM KCl, 15 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES, adjust pH to 7.5 by HCl
Cycloheximide stock			10 mg/ml in water. Store 1 ml aliquots at -20 °C.
Cytochalasin B stock			5 mg/ml in DMSO. Store 20 μl aliquots at -20 °C.
Dithiothreitol (DTT) stock			1 M in water. Store 1 ml aliquots at -20 °C.
ELB			0.25 M sucrose, 1 mM DTT, 50 μg/ml cycloheximide, 2.5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH7.7
Nocodazole stock			10 mg/ml in DMSO. Store 5 μl aliquots at -80 °C.
Energy Mixture			375 mM creatine phosphate, 50 mM ATP, and 25 mM MgCl2. Aliquots are saved at -80 °C.
Nuclear dye solution			0.4 μg/ml Hoechst 33258, 25% glycerol (v/v), in 1x PBS
Tautomycin stock			100 μM in DMSO. Store 10 μl aliquots at -80 °C.