دراسة الحمض النووي حاجز الضرر باستخدام<em> القيطم</emمقتطفات البيض>
Summary
القيطم البيض هو نظام استخراج نموذجا مفيدا للتحقيق في نقطة تفتيش الحمض النووي من التلف. هذا البروتوكول هو لإعداد مستخلصات البيض القيطم والكواشف DNA حمل الضرر الحاجز. هذه التقنيات قابلة للتكيف مع مجموعة متنوعة من النهج DNA الضارة في دراسة الحمض النووي مما يشير الى نقطة التفتيش الضرر.
Abstract
على أساس يومي، وتتعرض الخلايا لمجموعة متنوعة من الشتائم الذاتية والبيئية. لمكافحة هذه الإهانات، تطورت الخلايا DNA حاجز الضرر يشير كآلية مراقبة لاستشعار الحمض النووي من التلف والاستجابات الخلوية مباشرة إلى الحمض النووي من التلف. هناك عدة مجموعات من البروتينات التي تسمى أجهزة الاستشعار، ومحولات الطاقة والمستجيبات المشاركة في الحمض النووي من التلف مما يشير الى نقطة تفتيش (الشكل 1). في هذا المسار المعقد يشير، ATR (ATM وRad3 ذات الصلة) هي واحدة من كاينيسات الرئيسية التي يمكن أن تستجيب لالحمض النووي من التلف والإجهاد النسخ المتماثل. يمكن تنشيط ATR الفوسفات ركائز لها المصب مثل Chk1 (كيناز حاجز 1). وبناء على ذلك، فسفرته والمفعلين Chk1 يؤدي إلى آثار المصب كثيرة في نقطة تفتيش DNA الضرر بما في ذلك الاعتقال دورة الخلية، وتفعيل النسخ، إصلاح الحمض النووي الضرر، وموت الخلايا المبرمج أو الشيخوخة (الشكل 1). عند تلف الحمض النووي، وعدم تفعيل نتائج الحمض النووي حاجز الضرر في unrepبثت الضرر، وبالتالي، عدم الاستقرار الجيني. ودراسة الحمض النووي حاجز الضرر توضيح كيفية الحفاظ على سلامة الخلايا الجينية وتوفير فهم أفضل لكيفية الأمراض التي تصيب الإنسان مثل السرطان، وتطوير.
القيطم المورق مقتطفات البيض والناشئة باعتبارها قوية خالية من الخلايا استخراج النظام النموذجي في الحمض النووي من التلف البحث الحاجز. وقد وصفت في البداية استخراج منخفضة السرعة (LSE) من قبل مجموعة Masui 1. إضافة لونين الحيوانات المنوية demembranated إلى نتائج LSE في تشكيل نواة حيث يتم نسخ DNA بطريقة محافظ جزئيا مرة واحدة في دورة الخلية.
يتم تشغيل إشارات حاجز ATR/Chk1-mediated مسار من الحمض النووي من التلف أو الإجهاد تكرار 2. وتستخدم حاليا طريقتين للحث على نقطة التفتيش الحمض النووي من التلف: النهج DNA الحمض النووي الضارة والأضرار محاكاة هياكل 3. يمكن أن يتسبب الحمض النووي من التلف بواسطة أشعة (UV) فوق البنفسجية، أشعة γ-، الميثيل methanesulfonate (MMS)، ميتوميسين C (MMC)، 4-nitroquinoline-1-أكسيد (4-NQO)، أو aphidicolin 3 و 4. هو وكيل MMS مؤلكل الذي يمنع تكرار الحمض النووي وينشط الحمض النووي من التلف ATR/Chk1-mediated نقطة تفتيش 4-7. أشعة فوق البنفسجية يؤدي أيضا الحمض النووي من التلف ATR/Chk1-dependent 8 نقطة تفتيش. الحمض النووي الأضرار محاكاة هيكل AT70 هو مجمع صلب من اثنين أليغنوكليوتيد] بولي (DA) 70 وبولي-70 (DT). وقد تم تطوير النظام في مختبر بيل AT70 دانفي ويستخدم على نطاق واسع للحث على نقطة تفتيش تابعة للإشارات ATR/Chk1 9-12.
هنا، نحن تصف بروتوكولات (1) لإعداد عصائر خالية من الخلايا البيض (LSE)، (2) لعلاج الحيوانات المنوية القيطم لونين مع اثنين من DNA مختلفة الإضرار النهج (MMS والأشعة فوق البنفسجية)، (3) لإعداد DNA الأضرار محاكاة هيكل AT70، و (4) لتحريك الحمض النووي من التلف ATR/Chk1-mediated تفتيش في بورصة لندن مع لونين الحيوانات المنوية التالفة أو DNA بنية الأضرار محاكاة.
Protocol
Discussion
هناك العديد من المزايا في دراسة الحمض النووي من التلف باستخدام حاجز القيطم مقتطفات البيض. استخدام مستخلصات البيض يوفر كمية كبيرة من خلايا خالية مقتطفات متزامنة في الطور البيني من دورة الخلية. ويمكن للمستخلصات البيض بسهولة وبتكلفة زهيدة بها. فمن السهل نسبيا على …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم هذا العمل في جزء من الأموال التي تقدمها جامعة نورث كارولينا في شارلوت، اتشوفيا الأساس صندوق للتميز أعضاء هيئة التدريس، ومنحة من NIGMS (R15GM101571).
Materials
| Reagents | |||
| Anti-Chk1 P-S344 antibody | Cell Signaling | 2348L | |
| Anti-Chk1 antibody | Santa Cruz | SC7898 | |
| Aprotinin | MP Biomedicals | 0219115880 | |
| Cycloheximide | Sigma | C7698-5G | |
| Cytochalasin B | EMD | 250233 | |
| Dithiothreitol (DTT) | VWR | JTF780-2 | |
| hCG | Sigma | CG10-10VL | |
| L-Cysteine | Sigma | C7352-1KG | |
| Leupeptin | VWR | 97063-922 | |
| Methyl methanesulfonate (MMS) | Sigma | 129925-5G | |
| Nocodazole | Sigma | M1404-2MG | |
| PMSG | Calbiochem | 367222 | |
| Sample buffer | Sigma | S3401 | |
| Tautomycin | Wako Chemicals USA | 209-12041 | |
| Equipment | |||
| Bucket for egg laying | Rubbermaid commercial products | 6308 | |
| CL2 IEC centrifuge with swinging bucket rotor | Thermo Scientific | 004260F | |
| HB6 swinging bucket rotor | Thermo Scientific | 11860 | |
| Sorvall RC6 plus superspeed centrifuge | Thermo Scientific | 46910 | |
| UV crosslinker | UVP | 95-0174-01 | |
| Solutions | |||
| 1x MMR | 100 mM NaCl, 2 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 2.5 mM CaCl2, 5 mM HEPES, adjust pH to 7.8 with 10 M NaOH | ||
| Aprotinin/Leupeptin stock | 10 mg/ml each in water. Store 20 μl aliquots at -80 °C. | ||
| Buffer X | 0.2 M sucrose, 80 mM KCl, 15 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES, adjust pH to 7.5 by HCl | ||
| Cycloheximide stock | 10 mg/ml in water. Store 1 ml aliquots at -20 °C. | ||
| Cytochalasin B stock | 5 mg/ml in DMSO. Store 20 μl aliquots at -20 °C. | ||
| Dithiothreitol (DTT) stock | 1 M in water. Store 1 ml aliquots at -20 °C. | ||
| ELB | 0.25 M sucrose, 1 mM DTT, 50 μg/ml cycloheximide, 2.5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH7.7 | ||
| Nocodazole stock | 10 mg/ml in DMSO. Store 5 μl aliquots at -80 °C. | ||
| Energy Mixture | 375 mM creatine phosphate, 50 mM ATP, and 25 mM MgCl2. Aliquots are saved at -80 °C. | ||
| Nuclear dye solution | 0.4 μg/ml Hoechst 33258, 25% glycerol (v/v), in 1x PBS | ||
| Tautomycin stock | 100 μM in DMSO. Store 10 μl aliquots at -80 °C. |
References
- Lohka, M. J., Masui, Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science. 220 (4598), 719-721 (1983).
- Cimprich, K. A., Cortez, D. ATR: an essential regulator of genome integrity. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (8), 616-627 (2008).
- Lupardus, P. J., Van, C., Cimprich, K. A. Analyzing the ATR-mediated checkpoint using Xenopus egg extracts. Methods. 41 (2), 222-231 (2007).
- Lupardus, P. J., Byun, T., Yee, M. C., Hekmat-Nejad, M., Cimprich, K. A. A requirement for replication in activation of the ATR-dependent DNA damage checkpoint. Genes Dev. 16 (18), 2327-2332 (2002).
- Stokes, M. P., Van Hatten, R., Lindsay, H. D., Michael, W. M. DNA replication is required for the checkpoint response to damaged DNA in Xenopus egg extracts. J. Cell Biol. 158 (5), 863-872 (2002).
- Kato, K., Strauss, B. Accumulation of an intermediate in DNA synthesis by HEp.2 cells treated with methyl methanesulfonate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71 (5), 1969-1973 (1974).
- Paulovich, A. G., Hartwell, L. H. A checkpoint regulates the rate of progression through S phase in S. cerevisiae in response to DNA damage. Cell. 82 (5), 841-847 (1995).
- Guo, Z., Kumagai, A., Wang, S. X., Dunphy, W. G. Requirement for Atr in phosphorylation of Chk1 and cell cycle regulation in response to DNA replication blocks and UV-damaged DNA in Xenopus egg extracts. Genes Dev. 14 (21), 2745-2756 (2000).
- Jazayeri, A., Balestrini, A., Garner, E., Haber, J. E., Costanzo, V. Mre11-Rad50-Nbs1-dependent processing of DNA breaks generates oligonucleotides that stimulate ATM activity. EMBO. J. 27 (14), 1953-1962 (2008).
- Kumagai, A., Dunphy, W. G. Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts. Mol. Cell. 6 (4), 839-849 (2000).
- Yan, S., Lindsay, H. D., Michael, W. M. Direct requirement for Xmus101 in ATR-mediated phosphorylation of Claspin bound Chk1 during checkpoint signaling. J. Cell Biol. 173 (2), 181-186 (2006).
- Shiotani, B., Zou, L. Single-stranded DNA orchestrates an ATM-to-ATR switch at DNA breaks. Mol. Cell. 33 (5), 547-558 (2009).
- Tutter, A. V., Walter, J. C. Chromosomal DNA replication in a soluble cell-free system derived from Xenopus eggs. Methods Mol. Biol. 322, 121-137 (2006).
- Cross, M. K., Powers, M. Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts. J. Vis. Exp. (18), e891 (2008).
