Xenopus Eiextrakt ist ein nützliches Modellsystem, um die DNA-Schäden Prüfpunkt untersuchen. Dieses Protokoll ist für die Herstellung von Xenopus Ei-Extrakten und DNA-Schaden induzierenden Prüfpunkt Reagenzien. Diese Techniken sind an eine Vielzahl von DNA-schädigenden Ansätze in der Untersuchung der DNA-Schädigung Prüfpunkt Signalisierung.
Auf einer täglichen Basis, werden die Zellen zu einer Vielzahl von endogenen und Umwelteinflüssen ausgesetzt. Um diese Beleidigungen zu bekämpfen, haben Zellen DNA damage checkpoint Signalisierung als Überwachungs-Mechanismus, um DNA-Schäden und direkte zelluläre Antworten auf DNA-Schäden spüren entwickelt. Es gibt mehrere Gruppen von Proteinen namens Sensoren, Wandlern und Effektoren in DNA damage checkpoint-Signalisierung (Abbildung 1) beteiligt. In diesem komplexen Signalwegs ist ATR (ATM und Rad3-bezogen) einer der wichtigsten Kinasen, die zu DNA-Schädigungen und Replikation Streß reagieren. Activated ATR kann phosphorylieren seine nachgelagerten Substrate wie Chk1 (Checkpoint Kinase 1). Folglich phosphoryliert und aktiviert Chk1 führt zu viele stromabwärts Wirkungen in der DNA-Schädigung Prüfpunkt einschließlich Zellzyklusarrest, Transkriptionsaktivierung, DNA-Schäden zu reparieren und Apoptose oder Seneszenz (Abbildung 1). Wenn DNA beschädigt ist, es nicht die DNA damage checkpoint Ergebnisse in UNREP aktivierenausgestrahlt Schäden und anschließend genomische Instabilität. Die Untersuchung der DNA damage checkpoint wird klären, wie Zellen genomischen Integrität zu erhalten und ein besseres Verständnis davon, wie Krankheiten, wie Krebs, zu entwickeln.
Xenopus laevis Ei Extrakte werden als starke zellfreien Extrakt Modellsystem in DNA-Schädigung Prüfpunkt Forschung entstehen. Low-Speed-Extrakt (LSE) wurde ursprünglich von der Masui Gruppe 1 beschrieben. Die Zugabe von demembranated Spermienchromatin LSE Ergebnisse in Keimbildung, wo DNA in einem semikonservativen fashion einmal pro Zellzyklus repliziert wird.
Die ATR/Chk1-mediated Checkpoint-Signalweg ist durch DNA-Schädigung oder Replikation Stress 2 ausgelöst. Zwei Methoden werden derzeit verwendet, um die DNA damage checkpoint induzieren: DNA-schädigende Ansätze und DNA-Schäden-ähnlichen Strukturen 3. DNA-Schädigung durch Ultraviolett (UV)-Bestrahlung, γ-Bestrahlung, induziert werden Methyl methanesulfonate (MMS), Mitomycin C (MMC), 4-nitrochinolin-1-oxid (4-NQO) oder Aphidicolin 3, 4. MMS ist ein Alkylierungsmittel, das DNA-Replikation hemmt und aktiviert der DNA-Schädigung ATR/Chk1-mediated Prüfpunkt 4-7. UV-Bestrahlung löst auch die ATR/Chk1-dependent DNA damage checkpoint 8. Die DNA-Schädigung nachahmende Struktur AT70 ist ein Komplex aus zwei getemperten Oligonukleotide Poly-(dA) 70 und Poly-(dT) 70. Die AT70 System wurde Bill Dunphy Labor entwickelt und wird häufig verwendet, um ATR/Chk1 Checkpoint Signalisierung 9-12 induzieren.
Hier beschreiben wir Protokollen (1) bis zellfreie Extrakte Ei (LSE) herzustellen, (2) an Xenopus Spermienchromatinstruktur mit zwei verschiedenen DNA schädigen Ansätze (MMS und UV), (3) zu behandeln, um die DNA-Schäden-nachahmende Struktur vorzubereiten AT70, und (4) die DNA-Schädigung ATR/Chk1-mediated Prüfpunkt in LSE mit beschädigten Spermienchromatinstruktur oder einem DNA-Schaden-nachahmende Struktur auslösen.
Es gibt mehrere Vorteile bei der Untersuchung der DNA-Schädigung unter Verwendung Prüfpunkt Xenopus Ei-Extrakten. Die Verwendung von Ei-Extrakten stellt eine große Menge von zellfreien Extrakten in Interphase des Zellzyklus synchronisiert. Die Ei-Extrakten kann leicht und kostengünstig hergestellt werden. Es ist relativ leicht zu DNA oder Chromatin beschädigen und einen Defekt in der DNA-Schädigung Checkpoint nach immunodepleting eines Zielproteins aus Eiextrakt offenbaren. Anschließend kann eine potenti…
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wird teilweise durch Mittel von der University of North Carolina in Charlotte, Wachovia Stiftungsfonds für Dozenten excellence, und einem Zuschuss von NIGMS (R15GM101571) vorgesehen ist.
Reagents | |||
Anti-Chk1 P-S344 antibody | Cell Signaling | 2348L | |
Anti-Chk1 antibody | Santa Cruz | SC7898 | |
Aprotinin | MP Biomedicals | 0219115880 | |
Cycloheximide | Sigma | C7698-5G | |
Cytochalasin B | EMD | 250233 | |
Dithiothreitol (DTT) | VWR | JTF780-2 | |
hCG | Sigma | CG10-10VL | |
L-Cysteine | Sigma | C7352-1KG | |
Leupeptin | VWR | 97063-922 | |
Methyl methanesulfonate (MMS) | Sigma | 129925-5G | |
Nocodazole | Sigma | M1404-2MG | |
PMSG | Calbiochem | 367222 | |
Sample buffer | Sigma | S3401 | |
Tautomycin | Wako Chemicals USA | 209-12041 | |
Equipment | |||
Bucket for egg laying | Rubbermaid commercial products | 6308 | |
CL2 IEC centrifuge with swinging bucket rotor | Thermo Scientific | 004260F | |
HB6 swinging bucket rotor | Thermo Scientific | 11860 | |
Sorvall RC6 plus superspeed centrifuge | Thermo Scientific | 46910 | |
UV crosslinker | UVP | 95-0174-01 | |
Solutions | |||
1x MMR | 100 mM NaCl, 2 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 2.5 mM CaCl2, 5 mM HEPES, adjust pH to 7.8 with 10 M NaOH | ||
Aprotinin/Leupeptin stock | 10 mg/ml each in water. Store 20 μl aliquots at -80 °C. | ||
Buffer X | 0.2 M sucrose, 80 mM KCl, 15 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES, adjust pH to 7.5 by HCl | ||
Cycloheximide stock | 10 mg/ml in water. Store 1 ml aliquots at -20 °C. | ||
Cytochalasin B stock | 5 mg/ml in DMSO. Store 20 μl aliquots at -20 °C. | ||
Dithiothreitol (DTT) stock | 1 M in water. Store 1 ml aliquots at -20 °C. | ||
ELB | 0.25 M sucrose, 1 mM DTT, 50 μg/ml cycloheximide, 2.5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH7.7 | ||
Nocodazole stock | 10 mg/ml in DMSO. Store 5 μl aliquots at -80 °C. | ||
Energy Mixture | 375 mM creatine phosphate, 50 mM ATP, and 25 mM MgCl2. Aliquots are saved at -80 °C. | ||
Nuclear dye solution | 0.4 μg/ml Hoechst 33258, 25% glycerol (v/v), in 1x PBS | ||
Tautomycin stock | 100 μM in DMSO. Store 10 μl aliquots at -80 °C. |