חקר מחסום הניזק לדנ"א באמצעות<em> Xenopus</em> תמציות ביצה
Summary
Xenopus ביצת התמצית היא מערכת מודל שימושית לחקור מחסום הניזק לדנ"א. פרוטוקול זה מיועד להכנת תמציות ביצת Xenopus ריאגנטים ישכנעו מחסום ניזק לדנ"א. טכניקות אלה הן התאמה למגוון של גישות מזיקות DNA במחקר של איתות מחסום הניזק לדנ"א.
Abstract
על בסיס יומי, תאים נחשפים למגוון של עלבונות אנדוגניים וסביבתיים. כדי להתמודד עם העלבונות האלה, תאים התפתחו מחסום ניזק לדנ"א איתות כמנגנון מעקב לחוש ניזק לדנ"א ותגובות תאיות ישירות לניזק לדנ"א. ישנן מספר קבוצות של חלבונים הנקראים חיישנים, מתמר וגורמים מעורבים באיתות מחסום ניזק לדנ"א (איור 1). במסלול איתות מורכבת זו, ATR (כספומט וRad3 קשור) הוא אחד מקינאזות העיקרית שיכול להגיב לניזק לדנ"א, ומתח שכפול. הפעיל ATR יכול phosphorylate מצעי מורדה כגון Chk1 (קינאז מחסום 1). כתוצאה מכך, פוספורילציה והפעיל Chk1 מוביל לתופעות רבות במורד מחסום הניזק לדנ"א, כוללים מעצר מחזור תא, הפעלת שעתוק, תיקון ניזק לדנ"א, ואפופטוזיס או הזדקנות (איור 1). כאשר ה-DNA פגומה, שלא הצליח להפעיל את תוצאות מחסום הניזק לדנ"א בunrepניזק שודר, ועקב כך חוסר יציבות, הגנומי. המחקר של מחסום הניזק לדנ"א יבהיר כיצד תאים לשמור על שלמות גנטית ולספק הבנה טובה יותר של איך מחלות אנושיות, כגון סרטן, להתפתח.
תמציות Xenopus laevis ביצה מתגלות כמערכת חזקה תא חינם תמצית מודל במחקר מחסום ניזק לדנ"א. תמצית מהירות נמוכה (LSE) בתחילה תארה Masui קבוצת 1. התוספת של הכרומטין הזרע demembranated לתוצאות LSE בהיווצרות גרעינים שבו DNA משוכפל באופנת semiconservative פעם אחת בכל מחזור התא.
מסלול איתות מחסום ATR/Chk1-mediated מופעל על ידי ניזק לדנ"א או מתח כפול 2. שתי שיטות עיקריות משמשת כיום כדי לגרום הניזק לדנ"א מחסום: גישות מזיקות DNA ומבני ניזק-DNA מחק 3. ניזק לדנ"א יכול להיגרם על ידי קרינת אולטרה סגולה (UV), γ-קרינה, מהתיל methanesulfonate (MMS), mitomycin C (MMC), 4-nitroquinoline-1-התחמוצת (4-NQO), או aphidicolin 3, 4. MMS הוא סוכן אלקילציה שמעכב שכפול הדנ"א ומפעיל את מחסום הניזק לדנ"א ATR/Chk1-mediated 4-7. קרינת UV גם מפעילה 8 מחסום הניזק לדנ"א ATR/Chk1-dependent. מבנה ה-DNA ניזק מחקי AT70 הוא מורכב משני annealed oligonucleotides פולי-(DA) 70 ופולי-70 (dT). AT70 המערכת פותחה במעבדתו של ביל דאנפי ונמצאת בשימוש נרחב כדי לגרום ATR/Chk1 איתות מחסום 9-12.
כאן, אנו מתארים פרוטוקולים (1) כדי להכין תמציות ביצת תא חינם (LSE), (2) לטיפול בכרומטין זרע עם DNA Xenopus שתי שונים לפגוע גישות (MMS ו UV), (3) כדי להכין את מבנה ה-DNA ניזק המחקים AT70, ו( 4) כדי לעורר את מחסום הניזק לדנ"א ATR/Chk1-mediated בLSE בכרומטין זרע פגום או מבנה ה-DNA ניזק מחקים.
Protocol
Discussion
ישנם מספר יתרונות בלימוד מחסום הניזק לדנ"א באמצעות תמציות Xenopus ביצים. השימוש בתמציות ביצה מספק כמות גדולה של תמציות תא חינם מסונכרנות בשלבי ביניים של מחזור התא. ניתן תמציות הביצים בקלות ובזול. זה יחסית קל לפגוע DNA או הכרומטין ולחשוף פגם במחסום הניזק לדנ"א לא?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת בחלקו על ידי כספים הניתנים על ידי אוניברסיטת צפון קרוליינה בשארלוט, קרן יסוד Wachovia למצוינות סגל, ומענק מNIGMS (R15GM101571).
Materials
| Reagents | |||
| Anti-Chk1 P-S344 antibody | Cell Signaling | 2348L | |
| Anti-Chk1 antibody | Santa Cruz | SC7898 | |
| Aprotinin | MP Biomedicals | 0219115880 | |
| Cycloheximide | Sigma | C7698-5G | |
| Cytochalasin B | EMD | 250233 | |
| Dithiothreitol (DTT) | VWR | JTF780-2 | |
| hCG | Sigma | CG10-10VL | |
| L-Cysteine | Sigma | C7352-1KG | |
| Leupeptin | VWR | 97063-922 | |
| Methyl methanesulfonate (MMS) | Sigma | 129925-5G | |
| Nocodazole | Sigma | M1404-2MG | |
| PMSG | Calbiochem | 367222 | |
| Sample buffer | Sigma | S3401 | |
| Tautomycin | Wako Chemicals USA | 209-12041 | |
| Equipment | |||
| Bucket for egg laying | Rubbermaid commercial products | 6308 | |
| CL2 IEC centrifuge with swinging bucket rotor | Thermo Scientific | 004260F | |
| HB6 swinging bucket rotor | Thermo Scientific | 11860 | |
| Sorvall RC6 plus superspeed centrifuge | Thermo Scientific | 46910 | |
| UV crosslinker | UVP | 95-0174-01 | |
| Solutions | |||
| 1x MMR | 100 mM NaCl, 2 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 2.5 mM CaCl2, 5 mM HEPES, adjust pH to 7.8 with 10 M NaOH | ||
| Aprotinin/Leupeptin stock | 10 mg/ml each in water. Store 20 μl aliquots at -80 °C. | ||
| Buffer X | 0.2 M sucrose, 80 mM KCl, 15 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES, adjust pH to 7.5 by HCl | ||
| Cycloheximide stock | 10 mg/ml in water. Store 1 ml aliquots at -20 °C. | ||
| Cytochalasin B stock | 5 mg/ml in DMSO. Store 20 μl aliquots at -20 °C. | ||
| Dithiothreitol (DTT) stock | 1 M in water. Store 1 ml aliquots at -20 °C. | ||
| ELB | 0.25 M sucrose, 1 mM DTT, 50 μg/ml cycloheximide, 2.5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH7.7 | ||
| Nocodazole stock | 10 mg/ml in DMSO. Store 5 μl aliquots at -80 °C. | ||
| Energy Mixture | 375 mM creatine phosphate, 50 mM ATP, and 25 mM MgCl2. Aliquots are saved at -80 °C. | ||
| Nuclear dye solution | 0.4 μg/ml Hoechst 33258, 25% glycerol (v/v), in 1x PBS | ||
| Tautomycin stock | 100 μM in DMSO. Store 10 μl aliquots at -80 °C. |
References
- Lohka, M. J., Masui, Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science. 220 (4598), 719-721 (1983).
- Cimprich, K. A., Cortez, D. ATR: an essential regulator of genome integrity. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (8), 616-627 (2008).
- Lupardus, P. J., Van, C., Cimprich, K. A. Analyzing the ATR-mediated checkpoint using Xenopus egg extracts. Methods. 41 (2), 222-231 (2007).
- Lupardus, P. J., Byun, T., Yee, M. C., Hekmat-Nejad, M., Cimprich, K. A. A requirement for replication in activation of the ATR-dependent DNA damage checkpoint. Genes Dev. 16 (18), 2327-2332 (2002).
- Stokes, M. P., Van Hatten, R., Lindsay, H. D., Michael, W. M. DNA replication is required for the checkpoint response to damaged DNA in Xenopus egg extracts. J. Cell Biol. 158 (5), 863-872 (2002).
- Kato, K., Strauss, B. Accumulation of an intermediate in DNA synthesis by HEp.2 cells treated with methyl methanesulfonate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71 (5), 1969-1973 (1974).
- Paulovich, A. G., Hartwell, L. H. A checkpoint regulates the rate of progression through S phase in S. cerevisiae in response to DNA damage. Cell. 82 (5), 841-847 (1995).
- Guo, Z., Kumagai, A., Wang, S. X., Dunphy, W. G. Requirement for Atr in phosphorylation of Chk1 and cell cycle regulation in response to DNA replication blocks and UV-damaged DNA in Xenopus egg extracts. Genes Dev. 14 (21), 2745-2756 (2000).
- Jazayeri, A., Balestrini, A., Garner, E., Haber, J. E., Costanzo, V. Mre11-Rad50-Nbs1-dependent processing of DNA breaks generates oligonucleotides that stimulate ATM activity. EMBO. J. 27 (14), 1953-1962 (2008).
- Kumagai, A., Dunphy, W. G. Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts. Mol. Cell. 6 (4), 839-849 (2000).
- Yan, S., Lindsay, H. D., Michael, W. M. Direct requirement for Xmus101 in ATR-mediated phosphorylation of Claspin bound Chk1 during checkpoint signaling. J. Cell Biol. 173 (2), 181-186 (2006).
- Shiotani, B., Zou, L. Single-stranded DNA orchestrates an ATM-to-ATR switch at DNA breaks. Mol. Cell. 33 (5), 547-558 (2009).
- Tutter, A. V., Walter, J. C. Chromosomal DNA replication in a soluble cell-free system derived from Xenopus eggs. Methods Mol. Biol. 322, 121-137 (2006).
- Cross, M. K., Powers, M. Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts. J. Vis. Exp. (18), e891 (2008).
