用いたDNA損傷チェックポイントの研究<em>アフリカツメガエル</em>卵抽出

Summary

アフリカツメガエルの卵抽出物は、DNA損傷チェックポイントを調査するために有用なモデル系である。このプロトコルは、 アフリカツメガエルの卵抽出物とDNA損傷チェックポイント誘導試薬の調製のためのものです。これらの技術は、DNA損傷チェックポイントシグナル伝達の研究ではDNA損傷の様々なアプローチに適応可能である。

Abstract

毎日のように、細胞は内因性と環境の様々な侮辱にさらされる。これらの侮辱に対抗するために、細胞はDNA損傷に対するDNA損傷と直接的な細胞応答を検知する監視機構としてシグナリングDNA損傷チェックポイントを進化させてきた。 DNA損傷チェックポイントシグナル（ 図1）に関わるセンサ、トランスデューサとエフェクターと呼ばれるタンパク質のいくつかのグループがあります。この複雑なシグナル伝達経路では、ATR（ATMとRAD3関連）がDNA損傷と複製ストレスに応答することができる主要なキナーゼの一つである。活性化されたATRは、そのようなのChk1（チェックポイントキナーゼ1）のような、その下流の基質をリン酸化することができます。その結果、リン酸化され、活性化されChk1は、細胞周期の停止、転写活性化、DNA損傷修復、アポトーシスや老化（ 図1）を含むDNA損傷チェックポイントには多くの下 ​​流効果につながる。 DNAが損傷されると、unrepでDNA損傷チェックポイントの結果を有効にするには失敗放映された被害と、その後、ゲノム不安定性。 DNA損傷チェックポイントの研究では、細胞は、ゲノムの完全性を維持する方法を解明し、癌などの方法ヒト疾患のより良い理解を提供し、開発していきます。

アフリカツメガエル卵抽出液は、DNA損傷チェックポイントの研究に強力な無細胞抽出液をモデル系として浮上している。低速抽出（LSE）は、当初、増井グループ¹によって記述されていた。 DNAは細胞周期ごとに必ず一度、半保存方法で複製されている核形成のLSEの結果にdemembranated精子クロマチンの追加。

ATR/Chk1-mediatedチェックポイントシグナル伝達経路はDNA損傷や複製ストレス²によってトリガされます。 DNA損傷のアプローチとDNA損傷を模倣構造^3：2つの方法は、現在、DNA損傷チェックポイントを誘導するために使用されています。 DNA損傷は、紫外線（UV）照射、γ線照射、メチルメタンによって誘導することができるesulfonate（MMS）、マイトマイシンC（MMC）、4 -ニトロキノリン-1 -オキシド（4-NQO）、またはアフィジコリン^3、4。 MMSはDNA複製を阻害し、ATR/Chk1-mediated DNA損傷チェックポイントの活性化^4-7アルキル化剤である。 UV照射もATR/Chk1-dependent DNA損傷チェックポイント^8をトリガ^します 。 DNA損傷模倣構造AT70は、2つのオリゴヌクレオチド、ポリ – （DA）70とポリ（dT）を70のアニールされた複合体である。 AT70システムはビルダンフィーの研究室で開発したと^9月12日 、広くATR/Chk1チェックポイントシグナル伝達を誘導するために使用されています。

ここでは、（2）DNA損傷模倣構造を準備するために2つの異なるDNA損傷のアプローチ（MMSとUV）、（3）でアフリカツメガエルの精子クロマチンを治療するために、無細胞卵抽出（LSE）を準備するためのプロトコルは、（1）について説明AT70、（4）損傷した精子クロマチンまたはDNA損傷を模倣する構造を持つLSEでATR/Chk1-mediated DNA損傷チェックポイントをトリガします。

Protocol

1。 LSEの準備雌のカエル（ アフリカツメガエル ） は採卵のために二度注射する。最初の注入（プライミング）は、カエルあたり100 U PMSG（妊馬血清性性腺刺激ホルモン）です。カエルは、少なくとも2日間卵を敷設し、下塗りしたカエルを誘導する前に下塗りしなければならない最大2週間のために使用可能である。素数カエルに、3 mlのシリンジと27Gの針を用いて背部リ?…

Discussion

アフリカツメガエルの卵抽出液を用いたDNA損傷チェックポイントを研究する際にはいくつかの利点があります。卵抽出物の使用は、細胞周期の間期で同期無細胞抽出液を大量に提供しています。卵抽出物を容易かつ安価に行うことができます。これは、DNAやクロマチンを損傷すると卵抽出液から目的タンパク質をimmunodepleting後のDNA損傷チェックポイントの欠陥を明らかにすることは比…

Materials

			Reagents
Anti-Chk1 P-S344 antibody	Cell Signaling	2348L
Anti-Chk1 antibody	Santa Cruz	SC7898
Aprotinin	MP Biomedicals	0219115880
Cycloheximide	Sigma	C7698-5G
Cytochalasin B	EMD	250233
Dithiothreitol (DTT)	VWR	JTF780-2
hCG	Sigma	CG10-10VL
L-Cysteine	Sigma	C7352-1KG
Leupeptin	VWR	97063-922
Methyl methanesulfonate (MMS)	Sigma	129925-5G
Nocodazole	Sigma	M1404-2MG
PMSG	Calbiochem	367222
Sample buffer	Sigma	S3401
Tautomycin	Wako Chemicals USA	209-12041
			Equipment
Bucket for egg laying	Rubbermaid commercial products	6308
CL2 IEC centrifuge with swinging bucket rotor	Thermo Scientific	004260F
HB6 swinging bucket rotor	Thermo Scientific	11860
Sorvall RC6 plus superspeed centrifuge	Thermo Scientific	46910
UV crosslinker	UVP	95-0174-01
			Solutions
1x MMR			100 mM NaCl, 2 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 2.5 mM CaCl2, 5 mM HEPES, adjust pH to 7.8 with 10 M NaOH
Aprotinin/Leupeptin stock			10 mg/ml each in water. Store 20 μl aliquots at -80 °C.
Buffer X			0.2 M sucrose, 80 mM KCl, 15 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES, adjust pH to 7.5 by HCl
Cycloheximide stock			10 mg/ml in water. Store 1 ml aliquots at -20 °C.
Cytochalasin B stock			5 mg/ml in DMSO. Store 20 μl aliquots at -20 °C.
Dithiothreitol (DTT) stock			1 M in water. Store 1 ml aliquots at -20 °C.
ELB			0.25 M sucrose, 1 mM DTT, 50 μg/ml cycloheximide, 2.5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH7.7
Nocodazole stock			10 mg/ml in DMSO. Store 5 μl aliquots at -80 °C.
Energy Mixture			375 mM creatine phosphate, 50 mM ATP, and 25 mM MgCl2. Aliquots are saved at -80 °C.
Nuclear dye solution			0.4 μg/ml Hoechst 33258, 25% glycerol (v/v), in 1x PBS
Tautomycin stock			100 μM in DMSO. Store 10 μl aliquots at -80 °C.