Studie av DNA Damage Checkpoint hjelp<em> Xenopus</em> Egg ekstrakter

Summary

Xenopus egg ekstrakt er et nyttig modellsystem for å undersøke DNA-skader sjekkpunkt. Denne protokollen er for utarbeidelse av Xenopus egg ekstrakter og DNA-skade checkpoint inducing reagenser. Disse teknikkene kan tilpasses en rekke DNA skadelige tilnærminger i studiet av DNA skade sjekkpunkt signalering.

Abstract

På en daglig basis, blir cellene utsatt for en rekke av endogene og miljømessige fornærmelser. For å bekjempe disse fornærmelser, har cellene utviklet seg DNA-skader sjekkpunkt signaliserer som overvåking mekanisme for å oppfatte DNA skade og direkte cellulære responser til DNA-skader. Det er flere grupper av proteiner som kalles sensorer, givere og effektbokser involvert i DNA-skader sjekkpunkt signalering (figur 1). I dette komplekset signalveien, er ATR (ATM og Rad3-relatert) en av de store kinaser som kan svare på DNA skade og replikering stress. Aktivert ATR kan phosphorylate sine nedstrøms underlag som Chk1 (Checkpoint kinase 1). Følgelig fosforylert og aktiveres Chk1 fører til mange nedstrøms effekter i DNA skade sjekkpunkt inkludert cellesyklus, transkripsjon aktivering, DNA skade reparasjon, og apoptose eller senescence (figur 1). Når DNA er skadet, unnlater å aktivere DNA-skade sjekkpunkt resultater i unrepluftes skader og senere, genomisk ustabilitet. Studiet av DNA skade sjekkpunkt vil belyse hvordan cellene opprettholde genomisk integritet og gir en bedre forståelse av hvordan menneskelige sykdommer, så som kreft, utvikle.

Xenopus laevis egg ekstrakter er fremstår som en kraftig celle-ekstrakt modellsystem i DNA-skader sjekkpunkt forskning. Lav hastighet ekstrakt (LSE) ble opprinnelig beskrevet av Masui gruppe ^1. Tilsetningen av demembranated sperm kromatin til LSE resulterer i kjerner formasjonen der DNA er replikert i en semiconservative mote gang per cellesyklus.

Den ATR/Chk1-mediated sjekkpunkt signalveien er utløst av DNA-skader eller replikering stress ^2. To metoder brukes i dag til å indusere DNA skade sjekkpunkt: DNA skadelige tilnærminger og DNA skade-etterligne strukturer ^tre. DNA-skade kan induseres ved ultrafiolett (UV) stråling, γ-bestråling, metyl methanesulfonate (MMS), mitomycin C (MMC), 4-nitrokinolin-1-oksyd (4-NQO), eller Aphidicolin ^{3, 4.} MMS er et alkylerende agent som hemmer DNA replikasjon og aktiverer ATR/Chk1-mediated DNA skade sjekkpunkt ^4-7. UV bestråling utløser også ATR/Chk1-dependent DNA skade sjekkpunkt ^8. DNA skade-etterligne strukturen AT70 er en annealed kompleks av to oligonukleotider poly-(dA) 70 og poly-(dT) 70. Den AT70 systemet ble utviklet i Bill Dunphy laboratorium og er mye brukt for å indusere ATR/Chk1 checkpoint signalering ^9-12.

Her beskriver vi protokoller (1) for å forberede cellefri egg ekstrakter (LSE), (2) å behandle Xenopus sperm kromatin med to forskjellige DNA skade tilnærminger (MMS og UV), (3) for å forberede den DNA skade-etterligne strukturen AT70, og (4) for å utløse ATR/Chk1-mediated DNA skade sjekkpunkt i LSE med skadet sperm kromatin eller en DNA skade-etterligne struktur.

Protocol

1. LSE Forberedelse Kvinnelige frosker (Xenopus laevis) er injisert to ganger for egg samling. Den første injeksjonen (priming) er 100 U PMSG (gravid Mare Serum gonadotropin) per frosk. Frosker må primes minst to dager før inducing egglegging og primet froskene er holdbare i opptil to uker. Å prime frosker, injisere PMSG subkutant i rygg lymph sacs med en 3 ml sprøyte og 27 G nål. Å indusere egglegging, injisere 500 U hCG (humant koriongonadotropin) per primet frosk subkutant i rygg …

Discussion

Det er flere fordeler ved å studere DNA skade sjekkpunkt med Xenopus egg ekstrakter. Bruken av egg ekstrakter gir en stor mengde celle-frie ekstrakter synkronisert ved interfase av cellesyklus. Egg ekstrakter kan enkelt og billig gjort. Det er relativt lett å skade DNA eller kromatin og for å avdekke en feil i DNA skade sjekkpunkt etter immunodepleting et mål protein fra egg ekstrakt. Deretter kan en potensiell funksjon defekt bli "reddet" av addback av vill type eller mutant rekombinante proteine…

Materials

			Reagents
Anti-Chk1 P-S344 antibody	Cell Signaling	2348L
Anti-Chk1 antibody	Santa Cruz	SC7898
Aprotinin	MP Biomedicals	0219115880
Cycloheximide	Sigma	C7698-5G
Cytochalasin B	EMD	250233
Dithiothreitol (DTT)	VWR	JTF780-2
hCG	Sigma	CG10-10VL
L-Cysteine	Sigma	C7352-1KG
Leupeptin	VWR	97063-922
Methyl methanesulfonate (MMS)	Sigma	129925-5G
Nocodazole	Sigma	M1404-2MG
PMSG	Calbiochem	367222
Sample buffer	Sigma	S3401
Tautomycin	Wako Chemicals USA	209-12041
			Equipment
Bucket for egg laying	Rubbermaid commercial products	6308
CL2 IEC centrifuge with swinging bucket rotor	Thermo Scientific	004260F
HB6 swinging bucket rotor	Thermo Scientific	11860
Sorvall RC6 plus superspeed centrifuge	Thermo Scientific	46910
UV crosslinker	UVP	95-0174-01
			Solutions
1x MMR			100 mM NaCl, 2 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 2.5 mM CaCl2, 5 mM HEPES, adjust pH to 7.8 with 10 M NaOH
Aprotinin/Leupeptin stock			10 mg/ml each in water. Store 20 μl aliquots at -80 °C.
Buffer X			0.2 M sucrose, 80 mM KCl, 15 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES, adjust pH to 7.5 by HCl
Cycloheximide stock			10 mg/ml in water. Store 1 ml aliquots at -20 °C.
Cytochalasin B stock			5 mg/ml in DMSO. Store 20 μl aliquots at -20 °C.
Dithiothreitol (DTT) stock			1 M in water. Store 1 ml aliquots at -20 °C.
ELB			0.25 M sucrose, 1 mM DTT, 50 μg/ml cycloheximide, 2.5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH7.7
Nocodazole stock			10 mg/ml in DMSO. Store 5 μl aliquots at -80 °C.
Energy Mixture			375 mM creatine phosphate, 50 mM ATP, and 25 mM MgCl2. Aliquots are saved at -80 °C.
Nuclear dye solution			0.4 μg/ml Hoechst 33258, 25% glycerol (v/v), in 1x PBS
Tautomycin stock			100 μM in DMSO. Store 10 μl aliquots at -80 °C.