Estudio del Checkpoint Daño del ADN utilizando<em> Xenopus</em> Extractos de huevo

Summary

Xenopus huevo extracto es un sistema modelo útil para investigar el punto de control de daño en el DNA. Este protocolo es para la preparación de extractos de huevo de Xenopus y reactivos de punto de control de daño de ADN que inducen. Estas técnicas son adaptables a una variedad de enfoques que dañan el ADN en el estudio de la señalización de punto de control de daño de ADN.

Abstract

Sobre una base diaria, las células se someten a una variedad de lesiones endógenas y ambientales. Para combatir estas agresiones, las células han evolucionado checkpoint daño en el DNA de señalización como un mecanismo de vigilancia para detectar daños en el ADN y dirigir la respuesta celular al daño del ADN. Hay varios grupos de proteínas llamadas sensores, transductores y efectores implicados en la señalización de punto de control de daños en el ADN (Figura 1). En esta vía de señalización complejo, ATR (ATM y Rad3 relacionada-) es una de las principales quinasas que pueden responder al daño del ADN y la replicación del estrés. ATR activados pueden fosforilar sus sustratos tales como aguas abajo (quinasa Chk1 Checkpoint 1). En consecuencia, fosforila y activa Chk1 conduce a muchos efectos aguas abajo en el punto de control de daño del ADN incluyendo la detención del ciclo celular, activación de la transcripción, reparación de daños en el ADN, y la apoptosis o senescencia (Figura 1). Cuando el ADN está dañado, no activa los resultados de punto de control de daño del ADN en UNREPdaños al aire y, posteriormente, la inestabilidad genómica. El estudio del puesto de control el daño del ADN aclarará cómo las células mantener la integridad genómica y proporcionar un mejor entendimiento de cómo las enfermedades humanas, tales como el cáncer, desarrollar.

Xenopus laevis extractos de huevo se están convirtiendo en un poderoso sistema libre de células modelo de extracto en la investigación puesto de control de daños en el ADN. Baja velocidad extracto (LSE) fue descrito inicialmente por el grupo Masui ^1. La adición de cromatina de los espermatozoides demembranated a los resultados de LSE en la formación de núcleos cuando el ADN se replica de manera semiconservativa una vez por ciclo celular.

El puesto de control vía de señalización ATR/Chk1-mediated es desencadenada por el estrés o daño en el ADN de replicación ^2. Dos métodos se utilizan actualmente para inducir el punto de control de daño en el ADN: los enfoques que dañan el ADN y el ADN que imitan las estructuras de ^daños-3. Daño del ADN puede ser inducida por la radiación ultravioleta (UV), γ-irradiación, metilo metanonaesulfonate (MMS), mitomicina C (MMC), 4-nitroquinolina-1-óxido (4-NQO), o afidicolina ^{3, 4.} MMS es un agente alquilante que inhibe la replicación del ADN y activa el punto de control de daños del ADN ATR/Chk1-mediated ^4-7. Irradiación UV también provoca el daño del ADN ⁸ ATR/Chk1-dependent puesto de control. El daño en el ADN que imita la estructura AT70 es un complejo de recocido de dos oligonucleótidos poli-(dA) 70 y poli-70 (dT). El sistema AT70 fue desarrollado en el laboratorio Bill Dunphy y es ampliamente utilizada para inducir ATR/Chk1 señalización de punto de control ^9-12.

Aquí, se describen protocolos (1) para preparar extractos libres de células de huevo (LSE), (2) para el tratamiento de la cromatina de esperma de Xenopus con dos ADN diferentes enfoques dañar (MMS y UV), (3) para preparar el ADN daños que imita la estructura AT70, y (4) para activar el punto de control de daños del ADN ATR/Chk1-mediated en LSE con cromatina de esperma dañado o una estructura que imita a daño en el DNA.

Protocol

1. Preparación LSE Ranas hembra (Xenopus laevis) se inyecta dos veces para la recolección de huevos. La primera inyección (cebado) es 100 U PMSG (gonadotropina sérica de yegua preñada) por rana. Las ranas se debe purgar por lo menos dos días antes de la inducción de huevo y por el que se ranas cebados son utilizables para un máximo de dos semanas. Para las ranas primos, inyectar PMSG por vía subcutánea en los sacos linfáticos dorsales usando una jeringa de 3 ml y aguja 27 G. Para…

Discussion

Hay varias ventajas en el estudio del punto de control de daño en el DNA utilizando extractos de Xenopus huevo. El uso de extractos de huevo proporciona una gran cantidad de extractos libres de células sincronizadas en la interfase del ciclo celular. Los extractos de huevo puede ser realizado fácilmente y económicamente. Es relativamente fácil de dañar el ADN o cromatina y para revelar un defecto en el punto de control de daño de ADN después de immunodepleting una proteína diana a partir de extracto de…

Materials

			Reagents
Anti-Chk1 P-S344 antibody	Cell Signaling	2348L
Anti-Chk1 antibody	Santa Cruz	SC7898
Aprotinin	MP Biomedicals	0219115880
Cycloheximide	Sigma	C7698-5G
Cytochalasin B	EMD	250233
Dithiothreitol (DTT)	VWR	JTF780-2
hCG	Sigma	CG10-10VL
L-Cysteine	Sigma	C7352-1KG
Leupeptin	VWR	97063-922
Methyl methanesulfonate (MMS)	Sigma	129925-5G
Nocodazole	Sigma	M1404-2MG
PMSG	Calbiochem	367222
Sample buffer	Sigma	S3401
Tautomycin	Wako Chemicals USA	209-12041
			Equipment
Bucket for egg laying	Rubbermaid commercial products	6308
CL2 IEC centrifuge with swinging bucket rotor	Thermo Scientific	004260F
HB6 swinging bucket rotor	Thermo Scientific	11860
Sorvall RC6 plus superspeed centrifuge	Thermo Scientific	46910
UV crosslinker	UVP	95-0174-01
			Solutions
1x MMR			100 mM NaCl, 2 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 2.5 mM CaCl2, 5 mM HEPES, adjust pH to 7.8 with 10 M NaOH
Aprotinin/Leupeptin stock			10 mg/ml each in water. Store 20 μl aliquots at -80 °C.
Buffer X			0.2 M sucrose, 80 mM KCl, 15 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES, adjust pH to 7.5 by HCl
Cycloheximide stock			10 mg/ml in water. Store 1 ml aliquots at -20 °C.
Cytochalasin B stock			5 mg/ml in DMSO. Store 20 μl aliquots at -20 °C.
Dithiothreitol (DTT) stock			1 M in water. Store 1 ml aliquots at -20 °C.
ELB			0.25 M sucrose, 1 mM DTT, 50 μg/ml cycloheximide, 2.5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH7.7
Nocodazole stock			10 mg/ml in DMSO. Store 5 μl aliquots at -80 °C.
Energy Mixture			375 mM creatine phosphate, 50 mM ATP, and 25 mM MgCl2. Aliquots are saved at -80 °C.
Nuclear dye solution			0.4 μg/ml Hoechst 33258, 25% glycerol (v/v), in 1x PBS
Tautomycin stock			100 μM in DMSO. Store 10 μl aliquots at -80 °C.