Kullanılarak DNA hasar Checkpoint incelenmesi<em> Xenopus</em> Yumurta ayıklar
Summary
Xenopus yumurta özü DNA hasarı kontrol noktasında araştırmak için yararlı bir model sistemidir. Bu protokol, Xenopus yumurta özü ve DNA hasarına neden olan kontrol noktası reaktiflerin hazırlanması içindir. Bu teknikler DNA hasar kontrol noktası sinyalleşmenin çalışmada DNA hasarına yaklaşımların çeşitli uyarlanabilir.
Abstract
Günlük olarak, hücreler, endojen ve çevresel hasarlar çeşitli tabi tutulur. Bu hakaretler mücadele etmek için, hücrelerin DNA hasarı ve DNA hasarı doğrudan hücresel yanıtları anlamda bir gözetim mekanizması olarak sinyalizasyon DNA hasarı kontrol noktasında gelişmiştir. DNA hasarı kontrol noktasında sinyal (Şekil 1) yer alan sensörler, transdüserler ve etkileyiciler adlandırılan proteinlerin birkaç grup vardır. Bu kompleks sinyal yolu olarak, ATR (ATM ve RAD3 ile ilgili) DNA hasarına ve çoğaltma strese cevap verebilecek kinazları önemli biridir. Aktif ATR gibi Chk1 olarak aşağı yüzeylerde (Checkpoint kinaz 1) fosforile edebilir. Sonuç olarak, fosforilasyona ve hücre döngüsünün durması, transkripsiyon aktivasyonu, DNA hasarının tamiri ve apoptosis ya da yaşlılık (Şekil 1) dahil olmak üzere DNA hasar kontrol noktası olarak çok sayıda alt-etkilere yol açar Chk1 aktive edildi. DNA hasar gördüğünde, unrep yılında DNA hasarı kontrol noktasında sonuçlar etkinleştirmek için başarısızyayınlanan hasar ve, sonradan, genomik instabilite. DNA hasarı kontrol noktasında çalışma hücrelerinin genomik bütünlüğünü korumak nasıl açıklamak ve kanser gibi insan hastalıkları, nasıl geliştiğini daha iyi anlaşılmasını sağlayacaktır.
Xenopus laevis yumurta özleri DNA hasarı kontrol noktasında araştırma güçlü bir hücre serbest ekstresi model sistem olarak ortaya çıkmaktadır. Düşük hızda ekstresi (LSE) başlangıçta Masui grup 1 de tarif edilmiştir. DNA kez hücre döngüsü başına semiconservative moda çoğaltılır çekirdeklerin oluşumu LSE sonuçlarına demembranated spermin kromatin eklenmesi.
ATR/Chk1-mediated noktası sinyal yolağı DNA hasarı veya çoğaltma stres 2 tarafından tetiklenir. DNA hasar yaklaşımlar ve DNA hasar taklit eden yapılar 3: iki yöntem, şu anda DNA hasar noktası indüklemek için kullanılır. DNA hasar ultraviyole (UV) ışın tedavisi, γ-ışınlama, metil metan indüklenebiliresulfonate (MMS), mitomisin C (MMC), 4-nitroquinoline-1-oksit (4-NQO), afidikodin ya da 3, 4. MMS DNA replikasyonu inhibe eder ve ATR/Chk1-mediated DNA hasar kontrol noktası 4-7 aktive edilen bir alkilleştirme ajanı. UV radyasyona da ATR/Chk1-dependent DNA hasar kontrol noktası 8 tetikler. DNA hasar taklit eden yapı AT70 iki oligonükleotidlerin poli (dA) 70 ve poli-(dT) 70 ve tavlanmış bir komplekstir. AT70 sistemi Bill Dunphy laboratuvarında geliştirilen ve yaygın olarak 9-12 ATR/Chk1 kapısı sinyalizasyon ikna etmek için kullanılır.
Burada, (2) DNA hasarına taklit eden yapı hazırlamak için, iki farklı DNA zarar yaklaşımlar (PYS ve UV), (3) ile birlikte Xenopus sperm kromatin tedavi etmek için hücre içermeyen yumurta ekstreleri (LSE) maddesinin hazırlanması için protokolleri (1), tanımlamak AT70, ve (4) hasarlı sperm kromatin ya da bir DNA hasar taklit eden yapı ile LSE olarak ATR/Chk1-mediated DNA hasarını kontrol noktası tetikleyebilir.
Protocol
Discussion
Xenopus yumurta özler kullanılarak DNA hasarı kontrol noktasında eğitim çeşitli avantajları vardır. Yumurta ekstrelerin hücre döngüsünün ara yüzeyinde eşzamanlı hücre içermeyen özler bir çok miktarda içerir. Yumurta ekstreler kolay ve ucuz hale getirilebilir. Bu DNA veya kromatin zarar ve yumurta özü bir hedef protein immunodepleting sonra DNA hasarı kontrol noktasında bir kusur ortaya nispeten kolaydır. Daha sonra, bir olası fonksiyon bozukluğu vahşi tip ya da mutant rekombinan pr…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Charlotte, Kuzey Carolina Üniversitesi, öğretim mükemmellik için Wachovia vakıf fonu ve NIGMS (R15GM101571) hibe tarafından sağlanan fonların kısmen desteklenmektedir.
Materials
| Reagents | |||
| Anti-Chk1 P-S344 antibody | Cell Signaling | 2348L | |
| Anti-Chk1 antibody | Santa Cruz | SC7898 | |
| Aprotinin | MP Biomedicals | 0219115880 | |
| Cycloheximide | Sigma | C7698-5G | |
| Cytochalasin B | EMD | 250233 | |
| Dithiothreitol (DTT) | VWR | JTF780-2 | |
| hCG | Sigma | CG10-10VL | |
| L-Cysteine | Sigma | C7352-1KG | |
| Leupeptin | VWR | 97063-922 | |
| Methyl methanesulfonate (MMS) | Sigma | 129925-5G | |
| Nocodazole | Sigma | M1404-2MG | |
| PMSG | Calbiochem | 367222 | |
| Sample buffer | Sigma | S3401 | |
| Tautomycin | Wako Chemicals USA | 209-12041 | |
| Equipment | |||
| Bucket for egg laying | Rubbermaid commercial products | 6308 | |
| CL2 IEC centrifuge with swinging bucket rotor | Thermo Scientific | 004260F | |
| HB6 swinging bucket rotor | Thermo Scientific | 11860 | |
| Sorvall RC6 plus superspeed centrifuge | Thermo Scientific | 46910 | |
| UV crosslinker | UVP | 95-0174-01 | |
| Solutions | |||
| 1x MMR | 100 mM NaCl, 2 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 2.5 mM CaCl2, 5 mM HEPES, adjust pH to 7.8 with 10 M NaOH | ||
| Aprotinin/Leupeptin stock | 10 mg/ml each in water. Store 20 μl aliquots at -80 °C. | ||
| Buffer X | 0.2 M sucrose, 80 mM KCl, 15 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES, adjust pH to 7.5 by HCl | ||
| Cycloheximide stock | 10 mg/ml in water. Store 1 ml aliquots at -20 °C. | ||
| Cytochalasin B stock | 5 mg/ml in DMSO. Store 20 μl aliquots at -20 °C. | ||
| Dithiothreitol (DTT) stock | 1 M in water. Store 1 ml aliquots at -20 °C. | ||
| ELB | 0.25 M sucrose, 1 mM DTT, 50 μg/ml cycloheximide, 2.5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH7.7 | ||
| Nocodazole stock | 10 mg/ml in DMSO. Store 5 μl aliquots at -80 °C. | ||
| Energy Mixture | 375 mM creatine phosphate, 50 mM ATP, and 25 mM MgCl2. Aliquots are saved at -80 °C. | ||
| Nuclear dye solution | 0.4 μg/ml Hoechst 33258, 25% glycerol (v/v), in 1x PBS | ||
| Tautomycin stock | 100 μM in DMSO. Store 10 μl aliquots at -80 °C. |
References
- Lohka, M. J., Masui, Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science. 220 (4598), 719-721 (1983).
- Cimprich, K. A., Cortez, D. ATR: an essential regulator of genome integrity. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (8), 616-627 (2008).
- Lupardus, P. J., Van, C., Cimprich, K. A. Analyzing the ATR-mediated checkpoint using Xenopus egg extracts. Methods. 41 (2), 222-231 (2007).
- Lupardus, P. J., Byun, T., Yee, M. C., Hekmat-Nejad, M., Cimprich, K. A. A requirement for replication in activation of the ATR-dependent DNA damage checkpoint. Genes Dev. 16 (18), 2327-2332 (2002).
- Stokes, M. P., Van Hatten, R., Lindsay, H. D., Michael, W. M. DNA replication is required for the checkpoint response to damaged DNA in Xenopus egg extracts. J. Cell Biol. 158 (5), 863-872 (2002).
- Kato, K., Strauss, B. Accumulation of an intermediate in DNA synthesis by HEp.2 cells treated with methyl methanesulfonate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71 (5), 1969-1973 (1974).
- Paulovich, A. G., Hartwell, L. H. A checkpoint regulates the rate of progression through S phase in S. cerevisiae in response to DNA damage. Cell. 82 (5), 841-847 (1995).
- Guo, Z., Kumagai, A., Wang, S. X., Dunphy, W. G. Requirement for Atr in phosphorylation of Chk1 and cell cycle regulation in response to DNA replication blocks and UV-damaged DNA in Xenopus egg extracts. Genes Dev. 14 (21), 2745-2756 (2000).
- Jazayeri, A., Balestrini, A., Garner, E., Haber, J. E., Costanzo, V. Mre11-Rad50-Nbs1-dependent processing of DNA breaks generates oligonucleotides that stimulate ATM activity. EMBO. J. 27 (14), 1953-1962 (2008).
- Kumagai, A., Dunphy, W. G. Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts. Mol. Cell. 6 (4), 839-849 (2000).
- Yan, S., Lindsay, H. D., Michael, W. M. Direct requirement for Xmus101 in ATR-mediated phosphorylation of Claspin bound Chk1 during checkpoint signaling. J. Cell Biol. 173 (2), 181-186 (2006).
- Shiotani, B., Zou, L. Single-stranded DNA orchestrates an ATM-to-ATR switch at DNA breaks. Mol. Cell. 33 (5), 547-558 (2009).
- Tutter, A. V., Walter, J. C. Chromosomal DNA replication in a soluble cell-free system derived from Xenopus eggs. Methods Mol. Biol. 322, 121-137 (2006).
- Cross, M. K., Powers, M. Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts. J. Vis. Exp. (18), e891 (2008).
