Blastomer Explantat att testa Cell Fate engagemang under embryonal utveckling

Summary

Ödet för en enskild embryonal cell kan påverkas av nedärvda molekyler och / eller av signaler från angränsande celler. Använda öde kartor över klyvning scenen Xenopus embryo kan enstaka blastomerer identifieras för kultur i isolering för att bedöma bidragen från ärvda molekyler jämfört cell-cell interaktioner.

Abstract

Fate kartor, uppbyggda av härstamning spåra alla celler i ett embryo, avslöja vilka vävnader ner från varje cell i embryot. Även öde kartor är mycket användbara för att identifiera föregångarna till ett organ och för att belysa den utvecklingsmässiga vägen genom vilken underordnade celler befolkar den organ i normalt embryo, inte visar de inte den fulla utvecklingspotentialen i en prekursorcell eller identifiera de mekanismer genom vilka dess öde avgörs. För att testa för cell öde engagemang, jämför en en cell normala repertoar av ättlingar i det intakta embryot (öde kartan) med dem som uttrycks efter en experimentell manipulation. Är cellens öde fast (engagerad) oavsett omgivande cellulära miljön eller är det påverkas av yttre faktorer som tillhandahålls av sina grannar? Använda omfattande öde kartor över Xenopus embryot, beskriver vi hur man identifierar, isolera och kultur enstaka klyvning prekursorer steg, som kallas Blastotjärnar. Detta tillvägagångssätt gör att man kan bedöma om dessa tidiga celler är engagerade i öde de får i sin normala miljö i intakta embryot kräver interaktion med sina angränsande celler eller kan påverkas för att uttrycka alternativa öden om de utsätts för andra typer av signaler.

Introduction

Xenopus laevis embryon har använts i stor utsträckning för att identifiera de mekanismer som embryonala celler får sin specifika öden eftersom deras ägg är stora nog för att tillåta mikrokirurgiska metoder. Dessutom utvecklar de externt utan behov av näringstillskott av odlingsmediet, eftersom varje cell innehåller en rik intracellulär tillförsel av äggula blodplättar som ger en inneboende energi butik. En viktig tillgång för att studera de mekanismer som celler öde bestäms är omfattande öde kartor över blastomererna klyvning scenen (från 2 – genom 32-cell steg) ^{1, 2, 3, 4, 5, 6.} Dessa kartor konstruerades genom microinjecting en detekterbar molekyl till en enda, identifierbar blastomer och övervakning senare utveckling där vävnader befolkas av den märkta avkomma. Konsekvent öde kartor är möjligt eftersom de huvudsakliga axlar embryon tillförlitligt kan identifieras i många Embryos. Först, i alla vildtyp embryon djuret halvklotet är pigmenterad, medan vegetabiliskt halvklotet är det inte. Det andra, orsakar inträde av spermier vid befruktningen en sammandragning av djurets halvklotet pigmentering mot framtiden ventrala sidan, i många embryon en pigmentering skillnad kan därför användas för att särskilja mellan dorsala och ventrala sidor. Tredje approximerar den första klyvningen fåra mitten sagittalplan i de flesta embryon, och kan således användas för att identifiera de högra och vänstra sidorna av embryot. Öde kartorna har även åberopat det faktum att naturligt befruktade ägg ofta klyver i regelbundna mönster som gör varje blastomer identifierbar över en stor population av embryon. Även om det finns variationer inom och mellan kopplingar av ägg om pigmentering och klyvning mönster, med urvalsförfaranden som beskrivs häri tillåter celler med föreskrivna öden kan identifieras med ca 90% noggrannhet.

Cell öden kan avskräckabryts under embryogenes genom flera mekanismer. Inneboende faktorer som differentiellt nedärvda cytoplasmiska mRNA eller proteiner, bidrar till flera aspekter av tidig mönstring. Till exempel specifika maternella mRNA bestämmer vilka celler kommer att bidra till könsceller, bli endoderm, eller bidra till rygg kroppen axeln (granskas ^7). Yttre faktorer som lokalt av angränsande celler eller mer avlägset från en embryonal signalering centrum, är ansvariga för inducering av specifika vävnadstyper och mönstring nästan alla organsystem. Exempel på signalering centra inkluderar arrangören / nod i gastrula som inducerar neural ektoderm och mönster mesoderm, och zonen för polariserande aktivitet som mönster främre-bakre axeln hos extremiteten knopp. Även öde kartor identifiera prekursorer till de olika organen och avslöja den utvecklingsmässiga väg som deras avkomlingar i normalt embryo, kan de inte skilja mellan inneboendeoch yttre påverkan på dessa celler. De också avslöjar inte hela utvecklingspotentialen i en cell, vars ättlingar differentiera den komplexa signalering miljön av embryot. Två experimentella metoder kan testa om en cells öde bestäms av inneboende faktorer eller därefter påverkas av yttre faktorer: 1) transplantation av cellen till en ny plats i embryot, eller 2) avlägsnande av cellen från embryot följt av kultur i frånvaro av exogena signaler.

Både experimentella tillvägagångssätt har varit möjlig i Xenopus eftersom cellerna är stora nog att manuellt separeras. Exempelvis har flera studier bort enstaka celler från embryon (att förändra cell-cell interaktioner) eller transplanterade celler till nya platser i värd embryon att testa för öde förändringar (granskats i ^{7, 8, 9).} Dessutom, det andra tillvägagångssättet för explantation små antal celler från olika regioner av embryot Into kultur att belysa induktiva vävnad interaktioner i frånvaro av exogena faktorer är möjlig eftersom cellerna i Xenopus embryon är fyllda med en intracellulär näringsämne lager, äggula blodplättar. Därför, kan de odlas under ett par dagar i ett definierat salt-medium utan näringsmässig eller tillväxtfaktor komplettering av odlingsmediet. Vi har använt denna metod för att visa att dorsala djur blastomerer har en autonom förmåga att producera neurala och dorsala mesodermala vävnader på grund av maternellt ärvd mRNA ^{10, 11,} och andra visade att mesoderm specificering av 32-cell blastomerer bygger på både inre och yttre information ¹² . En fördel med att odla celler som explantat är att mediet också kan kompletteras med definierade signalering faktorer för att avgöra vilken cell till cell kommunikation väg kan påverka ödet för den explanterade cellen ^{12, 13, 14.} Dessutom kan man injicera blastomer prior till kultur med mRNA att överuttrycka en gen, eller med anti-sense-oligonukleotider för att förhindra translation av endogena mRNA. Dessa, vinst-och förlust-av-funktion analyser kan identifiera vilka molekyler krävs för en självständigt uttryckt öde. För att analysera öde explantatet kan identifiera specifika celltyper utföras av vanlig genuttryck (t.ex. in situ hybridisering, RT-PCR) och immunocytokemiska analyser. Detta protokoll ger en enkel, men ändå kraftfull, sätt att skilja mellan inre och yttre mekanismer som reglerar hur en embryonal cell utvecklas till specifika vävnader.

Protocol

1. Beredning av Instrument, kultur Media och rätter Slipa fyra tång med aluminiumoxidslipmedel film. Gör detta under ett dissektionsmikroskop för att övervaka spetsen storlek. En pincett fungerar som en back-up ifall en spets skadas under förfarandet. Autoklavera alla fyra tång och lagra i en steril behållare. Gör 500 ml vardera av 0,1 X och 1,0 X odlingsmedium (antingen Marcs modifierade Ringers [MMR] eller Modifierat Barths Saline [MBS], recept i 15) och filter sterilisera. Vi …

Representative Results

Förmågan hos denna analys att exakt bedöma den utvecklingspotential av cellen är beroende dissekera ut rätt blastomer baserad på öde kartorna 1, 2, 3, 4, 5, 6. Därför är det viktigt att välja embryon med rätt pigmentering mönstret vid 2-cellstadiet, såsom illustreras i figur 1, som därefter följer vanliga klyvningsmönster, såsom visas i figur 2. Om en iakttar de sorterade embryon når önskad klyvning scenen och skiljer ut de embryon som visar oregelbundna k…

Discussion

De mest kritiska stegen för lyckad odling av enskilda blastomerer är: 1) korrekt identifiera blastomer av intresse, 2) att upprätthålla en steril, hälsosam kultur, 3) dissekera celler vid rätt del av cellcykeln, och 4) att utveckla den nödvändiga manuella fingerfärdighet för att undvika skador vid dissekering och överföra till kulturen väl.

Att manipulera specifika blastomerer, är det viktigt att kunna identifiera de huvudsakliga axlarna. I Xenopus embryon, kan den dor…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Alumina abrasive film	Thomas Scientific	#6775E-38	Course (12 μm), for major repairs of forceps tips
Alumina abrasive film	Thomas Scientific	#6775E-46	Medium (3 μm), for fine sharpening of forceps tips
Alumina abrasive film	Thomas Scientific	#6775E-54	Fine (0.3 μm), for polishing of forceps tips
Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5	Fine Science Tools	#11252-30	These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased. Corrosive resistant so they can be autoclaved.
Gentamicin solution	Sigma	G1397	Add to medium on same day as use