Замораживание клеток человека ES

Summary

Здесь показано, как в нашей лаборатории замерзает оттенки человеческих линий стволовых эмбриональных клеток.

Abstract

Здесь показано, как в нашей лаборатории замерзает оттенки человеческих линий стволовых эмбриональных клеток. Здоровый, экспоненциально расширяется культуры промывают PBS для удаления остатков средств массовой информации, которые могли бы утолить Трипсин реакции. Утепленные 0,05% трипсина-EDTA затем добавляется для покрытия клетки, и пластины инкубировали в течение 5 минут при комнатной температуре. За это время клетки можно наблюдать округления, и колонии отрывая поверхности пластины. Нежный повторяется пипетирования удалит клеток и колоний от поверхности пластины. Трипсином клетки помещаются в стандартные коническую трубку с подогретого СМИ ЭСК ячейки погасить оставшиеся трипсина, а затем нити. Клетки ресуспендировали питательной среды в концентрации примерно один миллион клеток в одном мл среды, концентрации, что один замороженный аликвоту достаточно возродить культуру на 10 см тарелку. После клетки адекватно ресуспендировали, ледяной СМИ замораживания добавляют в равном объеме. Сотовые суспензии тщательно перемешать, аликвоты в замораживании флаконы, и позволили, чтобы медленно заморозить до-80С в течение 24 часов. Замороженные клетки могут затем переехал в паровой фазе жидкого азота для длительного хранения, или остаться при -80 в течение примерно шести месяцев.

Protocol

Здоровый, экспоненциально расширяется культуры промывают PBS для удаления остатков средств массовой информации, которые могли бы утолить Трипсин реакции. Утепленные 0,05% трипсина-EDTA затем добавляется для покрытия клетки, и пластины инкубировали в течение 5 минут при комнатной температуре. …

Discussion

Техника мы описываем для замораживания ячейки оттенков линий хорошо работает для эффективного хранения и воскрешения оттенков клеточных линий, а также любые клетка млекопитающего интересов. Замораживание небольшая часть клеток при каждом прохождении является важным фактором при работе с лини?…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
HuES Medium	medium			For aq total of 651.5 ml, add: 500 ml KO-DMEM + 6.5 ml PenStrep + 6.5 ml L- Glut + 6.5 ml NEAA 6.5 ml + beta-mercaptoethanol 0.6ul (14.3 M stock) + 65 ml Serum Replacement + 65 ml Plasmanate + 0.65 ml bFGF2 (~10 ng/mL final)
Freezing Medium	medium			80% FCS (fetal calf serum) + 20% DMSO (dimethyl sulphoxide). Stored at 4C.