Fiberoptisk implantation for kronisk Optogenetic Stimulation af hjernevæv
Summary
Udviklingen af optogenetics tilvejebringer nu midlerne til præcist stimulere genetisk definerede neuroner og kredsløb, både<em> In vitro</em> Og<em> In vivo</em>. Her beskriver vi konstruktionen og implantation af en fiberoptisk for kronisk photostimulation af hjernevæv.
Abstract
Afdækning mønstre af neuronal tilslutning har været en udfordring for både kliniske og basal neurovidenskab. Elektrofysiologi har været den gyldne standard til analyse mønstre af synaptisk konnektivitet, men parret elektrofysiologiske optagelser kan være både besværligt og eksperimentelt begrænsende. Udviklingen af optogenetics har indført en elegant fremgangsmåde til at stimulere neuroner og kredsløb, både de vitro 1 og in vivo 2,3. Ved at udnytte celletypespecifik promotor-aktivitet til at drive opsin ekspression i diskrete neuronale populationer, kan man præcist stimulere genetisk definerede neuronale undertyper i adskilte kredsløb 4-6. Godt beskrevne fremgangsmåder til stimulering af neuroner, herunder elektrisk stimulering og / eller farmakologiske manipulationer, er ofte celletype vilkårlig, invasiv og kan beskadige omgivende væv. Disse begrænsninger kan ændre normal synaptisk funktion og / eller kredsløb adfærd. Som følgeaf arten af manipuleringen, er de nuværende metoder ofte akut og terminal. Optogenetics giver evnen til at stimulere neuroner i et relativt uskadelige måde og i genetisk målrettede neuroner. De fleste undersøgelser med in vivo optogenetics øjeblikket anvender en optisk fiber ført gennem en implanteret kanyle 6,7, men begrænsninger ved denne fremgangsmåde indbefatter beskadiget hjernevæv med gentagen indføring af en optisk fiber, og potentielle brud på fiberen inde i kanylen. I betragtning af den blomstrende området optogenetics, er en mere pålidelig metode til kronisk stimulering nødvendig for at lette langtidsundersøgelser med minimal sikkerhed vævsskader. Her giver vi vores modificeret protokol som en video artiklen til at supplere metoden effektivt og elegant beskrevet i Sparta et al. 8 til fremstilling af en fiberoptisk implantat og dens permanent fiksering på kraniet af bedøvede mus, samt montering af fiberoptisk kobler forbinder implantatet til en lyskilde. Implantatet, forbundet med optiske fibre til en solid-state laser, muliggør en effektiv fremgangsmåde til kronisk photostimulate funktionelle neuronal kredsløb med mindre vævsbeskadigelse 9 under anvendelse af små, aftagelige, bindsler. Permanent fiksering af de fiberoptiske implantater giver konsekvent og langsigtet in vivo optogenetic undersøgelser af neuronale kredsløb i vågen, opfører mus 10 med minimal vævsskade.
Protocol
Discussion
Optogenetics er en kraftfuld ny teknik, der gør det muligt for hidtil uset kontrol over specifikke neuronale undertyper. Dette kan udnyttes til at modulere neurale kredsløb med anatomiske og temporale nøjagtighed, samtidig med at den celletype-vilkårlige og invasive effekter af elektrisk stimulation ved en elektrode. Implantation af fiber optik gør det muligt for konsekvent og kronisk stimulering af neurale kredsløb over flere sessioner i vågen, opfører mus med minimal skade på væv. Dette system, som oprindeli…
Acknowledgements
Vi vil erkende, at denne teknik oprindeligt blev beskrevet af Sparta et al. 2012 og er let tilpasset til anvendelse i vores laboratorium.
Materials
| Name of the Reagent or Equipment | Company | Catalogue # | Comments |
| LC Ferrule Sleeve | Precision Fiber Products (PFP) | SM-CS125S | 1.25 mm ID |
| FC MM Pre-Assembled Connector | PFP | MM-CON2004-2300 | 230 μm Ferrule |
| Miller FOPD-LC Disc | PFP | M1-80754 | For LC ferrules |
| Furcation tubing | PFP | FF9-250 | 900 μm o.d., 250 μm i.d. |
| MM LC Stick Ferrule 1.25 mm | PFP | MM-FER2007C-1270 | 127 μm ID Bore |
| MM LC Stick Ferrule 1.25 mm | PFP | MM-FER2007C-2300 | 230 μm ID Bore |
| Heat-curable epoxy, hardener and resin | PFP | ET-353ND-16OZ | |
| FC/PC and SC/PC Connector Polishing Disk | ThorLabs | D50-FC | For FC ferrules |
| Digital optical power and Energy Meter | ThorLabs | PM100D | Spectrophotometer |
| Polishing Pad | ThorLabs | NRS913 | 9″ x 13″ 50 Durometer |
| Aluminum oxide Lapping (Polishing) Sheets: 0.3, 1, 3, 5 μm grits | ThorLabs | LFG03P, LFG1P, LFG3P, LFG5P | |
| Standard Hard Cladding Multimode Fiber | ThorLabs | BFL37-200 | Low OH, 200 μm Core, 0.37 NA |
| Fiber Stripping Tool | ThorLabs | T10S13 | Clad/Coat: 200 μm / 300 μm |
| SILICA/SILICA Optical Fiber | Polymicro Technologies | FVP100110125 | High -OH, UV Enhanced, 0.22 NA |
| 1×1 Fiberoptic Rotary Joint | doric lenses | FRJ_FC-FC | |
| Mono Fiberoptic Patchcord | doric lenses | MFP_200/230/900-0.37_2m_FC-FC | |
| Heat shrink tubing, 1/8 inch | Allied Electronics | 689-0267 | |
| Heat gun | Allied Electronics | 972-6966 | 250 W; 750-800 °F |
| Cotton tipped applicators | Puritan Medical Products Company | 806-WC | |
| VetBond tissue adhesive | Fischer Scientific | 19-027136 | |
| Flash denture base acrylic | Yates Motloid | ColdPourPowder+Liq | |
| BONN Miniature Iris Scissors | Integra Miltex | 18-1392 | 3-1/2″(8.9cm), straight, 15 mm blades |
| Johns Hopkins Bulldog Clamp | Integra Miltex | 7-290 | 1-1/2″(3.8 cm), curved |
| MEGA-Torque Electric Lab Motor | Vector | EL-S | |
| Panther Burs-Ball #1 | Clarkson Laboratory | 77.1006 | |
| Violet Blue Laser System | CrystaLaser | CK473-050-O | Wavelength: 473 nm |
| Laser Power Supply | CrystaLaser | CL-2005 | |
| Dumont #2 Laminectomy Forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| Probe | Fine Science Tools | 10140-02 | |
| 5″Straight Hemostat | Excelta | 35-PH | |
| Vise with weighted base | Altex Electronics | PAN381 |
References
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neuronal activity. Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
- Arenkiel, B. R. In Vivo Light-Induced Activation of Neural Circuitry in Trangenic Mice Expressing Channelrhodopsin-2. Neuron. 54, 205-218 (2007).
- Gradinaru, V. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141, 165-16 (2010).
- Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits. Neuron. 57, 634-660 (2008).
- Arenkiel, B. R., Ehlers, M. D. Molecular genetic and imaging technologies for circuit based neuroanatomy. Nature. 461, 900-907 (2009).
- Zhang, F. Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures. Nat. Protoc. 5, 439-456 (2010).
- Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons. Nature. 450, 420-424 (2007).
- Sparta, D. R. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nature Protocols. 7, 12-23 (2012).
- Stuber, G. D. Excitatory transmission from the amygdala to nucleus accumbens facilitates reward seeking. Nature. 475, 377-380 (2011).
- Liu, X. Optogenetic stimulation of a hippocampal engram activates fear memory recall. Nature. 484, 381-385 (2012).
