Høyre systoletrykk Mål i kombinasjon med Harvest of Lung og Immune vevsprøver i Mus
Summary
En spesifikk og rask protokoll til samtidig undersøke høyre hjerte-funksjon, lungebetennelse, og immunrespons er beskrevet som et læremiddel. Video og tall beskriver fysiologi og mikrodisseksjon teknikker i en organisert team-tilnærming som er tilpasningsdyktig skal brukes til små til store studier.
Abstract
Funksjonen til høyre hjertet er å pumpe blodet gjennom lungene, og dermed knytte høyre hjerte fysiologi og pulmonal vaskulær fysiologi. Betennelse er en vanlig ombygging av hjerte-og lungefunksjon, ved å utarbeide mobilnettet infiltrasjon, produksjon av cytokiner og vekstfaktorer, og ved å initiere remodeling prosesser 1.
Sammenlignet med venstre hjertekammer, er høyre ventrikkel en lavtrykks pumpe som opererer i en relativt smal sone av trykkforandringer. Økte lungearterien presset er assosiert med økt trykk i lungen vaskulær seng og pulmonal hypertensjon 2. Pulmonal hypertensjon ofte er forbundet med inflammatoriske lungesykdommer, for eksempel kronisk obstruktiv lungesykdom, eller autoimmune sykdommer 3. Fordi pulmonal hypertensjon ensidige dårlig prognose for livskvalitet og levealder, er mye forskning rettet mot å forstå mekanismene som might være mål for farmasøytisk intervensjon 4. Hovedutfordringen for utvikling av effektive styringsverktøy for pulmonal hypertensjon fortsatt kompleksiteten samtidig forståelse av molekylære og cellulære endringer i høyre hjertet, lungene og immunsystemet.
Her presenterer vi en prosessuell arbeidsflyt for rask og presis måling av trykkforandringer i høyre hjertet av mus og samtidig høste av prøver fra hjertet, lungene og immunsystemet vev. Metoden er basert på direkte kateterisering av høyre ventrikkel via halsvenen på nært chested mus, først utviklet på slutten av 1990-tallet som surrogat mål på presset i lungearterien 5-13. Den organiserte team-tilnærming gjør en svært rask høyre hjerte kateterisering teknikk. Dette gjør det mulig å utføre målingene i mus som spontant puster romluft. Organiseringen av arbeidet-flow i forskjellige arbeids-områderreduserer tidsforsinkelse og åpner muligheten for å samtidig utføre fysiologi eksperimenter og høster immune, hjerte-og lunge vev.
Det prosessuelle arbeidsflyt skissert her kan tilpasses et bredt spekter av laboratoriet og studere design, fra små og målrettede eksperimenter, til store narkotika screening-analyser. Den samtidige kjøp av kardiale fysiologi data som kan utvides til å omfatte ekkokardiografi 5,14-17 og høsting av hjerte, lunge og immune vev reduserer antall dyr som trengs for å få data som beveger vitenskapelige kunnskapsgrunnlaget fremover. Det prosessuelle arbeidsflyt som presenteres her gir også et ideelt utgangspunkt for å få kunnskap om nett som knytter immune, lunge-og hjertefunksjonen. De samme prinsipper som er skissert her kan tilpasses å studere andre eller ytterligere organer etter behov.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den eksperimentelle flyt skissert her gir mulighet for rask og samtidig måling av høyre ventrikkel systolisk trykk og høste av prøver for analyse av svarene i lungene, hjertet og immunsystemet hos mus. Prosedyren kombinerer hjerte fysiologi målinger, mikro-disseksjon og påfølgende vev innhøsting for live celle studier, histologisk analyse, eller omics-analyse av vev. Hele prosedyren tar mindre enn 20 minutter per mus. På grunn av arbeid-området organisert arbeidsflyt, kan 2-3 dyr studeres samtidig. Derfor er f…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble finansiert av National Institutes of Health 1R21HL092370-01 (GG), 1R01 HL095764-01 (GG); R01HL082694 (JW), American Heart Association, Founders affiliate (0855943D, GG); Stony Wold – Herbert Fund, New York (SHP).
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Reagents | |||
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| disinfectant soap (Coverage Spray TB plus Steris) | Fisher Scientific | 1629-08 | |
| Ethyl Alcohol, 200 Proof, Absolute, Anhydrous ACS/USP Grade | PHARMCO-AAPER | 111000200 | Dilute to 70 % with distilled water |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F1635-500ML | Dilute to a 7-10 % formaldehyde concentration at a PBS concentration of 1x using PBS stock solution and water |
| Hanks solution, no calcium, magnesium | Fisher Scientific | 21-022-CV | |
| O.C.T | Tissue-Tek | 4583 | |
| Penicillin (10,000 U/ml) / Streptomycin (10,000 mg/ml) solution | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), no calcium, no magnesium, 1x and 10x solutions | Fisher Scientific | ||
| Sodium pentobarbital 26% | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-0471-01 | |
| Labware | |||
| Plates 12, 24, 96 well | Falcon | ||
| Transfer Pipet | Fisher Scientific | 13-711-9BM | |
| Tube, EDTA coated | Sarstedt | 2013-08 | |
| Tubes 0.65 ml and 1.7 ml micro-centrifuge | VWR | ||
| Tubes 12 x 75 mm polypropylene | Fisher Scientific | 14-956-1D | |
| Tubes, various sizes, polypropylene | Fisher Scientific | ||
| Instruments | |||
| Forceps, Dumon #5 Fine | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Forceps, extra fine graefe -0.5 mm tips curved | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Forceps, extra fine graefe -0.5 mm tips straight | Fine Science Tools | 11150-10 | |
| Cannula 18 ga, 19 ga | BD | Precision Glide Needles | Cut to optimal length, blunted and outside rasped to create a rough outside surface. |
| Scissors, Dissector scissors-slim blades 9 cm | Fine Science Tools | 14081-09 | |
| Suture for BAL, braided silk suture, 4-0 | Fine Science Tools | SP116 | |
| Suture for right heart catheterization, braided silk suture, 6-0 | Teleflex medical | 18020-60 | |
| Syringe, 1 ml | BD | 309659 | |
| Equipment | |||
| Amplifier, PowerLab 4/30 | ADInstrument | Model ML866 | |
| Catheter, pressure F1.4 | Millar Instruments, Inc | 840-6719 | |
| Dissecting Microscope | Variscope | ||
| Forceps, Vannas spring scissors-2 mm blades | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Halogen Illuminated Desk Magnifier | Fisher Scientific | 11-990-56 | |
| Laptop computer | Asus | Model number A52F i5 processor; 15 inch | |
| Light Source | Amscope | HL-250-A | |
| Pressure Control Unit | Millar Instruments, Inc | PCU-2000 | |
| Software, Labchart-Pro V.7 | AD Instruments |
References
- Price, L. C., et al. Inflammation in pulmonary arterial hypertension. Chest. 141, 210-221 (2012).
- Olschewski, H., et al. Cellular pathophysiology and therapy of pulmonary hypertension. J. Lab. Clin. Med. 138, 367-377 (2001).
- Hassoun, P. M., et al. Inflammation, growth factors, and pulmonary vascular remodeling. J. Am. Coll. Cardiol. 54, S10-S19 (2009).
- Rabinovitch, M. Molecular pathogenesis of pulmonary arterial hypertension. J. Clin. Invest. 118, 2372-2379 (2008).
- Steudel, W., et al. Sustained pulmonary hypertension and right ventricular hypertrophy after chronic hypoxia in mice with congenital deficiency of nitric oxide synthase 3. J. Clin. Invest. 101, 2468-2477 (1998).
- Zaidi, S. H., You, X. M., Ciura, S., Husain, M., Rabinovitch, M. Overexpression of the serine elastase inhibitor elafin protects transgenic mice from hypoxic pulmonary hypertension. Circulation. 105, 516-521 (2002).
- Guignabert, C., et al. Tie2-mediated loss of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma in mice causes PDGF receptor-beta-dependent pulmonary arterial muscularization. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 297, L1082-L1090 (2009).
- West, J., et al. Pulmonary hypertension in transgenic mice expressing a dominant-negative BMPRII gene in smooth muscle. Circ. Res. 94, 1109-1114 (2004).
- Cook, S., et al. Increased eNO and pulmonary iNOS expression in eNOS null mice. Eur. Respir. J. 21, 770-773 (2003).
- West, J., et al. Mice expressing BMPR2R899X transgene in smooth muscle develop pulmonary vascular lesions. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 295, L744-L755 (2008).
- Tu, L., et al. Autocrine fibroblast growth factor-2 signaling contributes to altered endothelial phenotype in pulmonary hypertension. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 45, 311-322 (2011).
- Daley, E., et al. Pulmonary arterial remodeling induced by a Th2 immune response. J. Exp. Med. 205, 361-372 (2008).
- Song, Y., et al. Inflammation, endothelial injury, and persistent pulmonary hypertension in heterozygous BMPR2-mutant mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295, 677-690 (2008).
- Thibault, H. B., et al. Noninvasive assessment of murine pulmonary arterial pressure: validation and application to models of pulmonary hypertension. Circulation. Cardiovascular imaging. 3, 157-163 (2010).
- Otto, C., et al. Pulmonary hypertension and right heart failure in pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide type I receptor-deficient mice. Circulation. 110, 3245-3251 (2004).
- Burton, V. J., et al. Attenuation of leukocyte recruitment via CXCR1/2 inhibition stops the progression of PAH in mice with genetic ablation of endothelial BMPR-II. Blood. 118, 4750-4758 (2011).
- Fujita, M., et al. Pulmonary hypertension in TNF-alpha-overexpressing mice is associated with decreased VEGF gene expression. J. Appl. Physiol. 93, 2162-2170 (2002).
- Motley, H. L., Cournand, A., Werko, L., Himmelstein, A., Dresdale, D. The Influence of Short Periods of Induced Acute Anoxia Upon Pulmonary Artery Pressures in Man. Am. J. Physiol. 150, 315-320 (1947).
- Liljestrand, G. Regulation of Pulmonary Arterial Blood Pressure. Arch. Intern. Med. 81, 162-172 (1948).
- Euler, U. S. V., Liljestrand, G. Observations on the pulmonary arterial blood pressure in the cat. Acta Physiol. Scand. 12, 301-320 (1946).
- Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice. Journal of immunological. 312, 12-19 (2006).
- Rabinovitch, M., et al. Angiotensin II prevents hypoxic pulmonary hypertension and vascular changes in rat. Am. J. Physiol. 254, 500-508 (1988).
- Rabinovitch, M., Gamble, W., Nadas, A. S., Miettinen, O. S., Reid, L. Rat pulmonary circulation after chronic hypoxia: hemodynamic and structural features. Am. J. Physiol. 236, 818-827 (1979).
- Rabinovitch, M., et al. Changes in pulmonary blood flow affect vascular response to chronic hypoxia in rats. Circ. Res. 52, 432-441 (1983).
- Kugathasan, L., et al. The angiopietin-1-Tie2 pathway prevents rather than promotes pulmonary arterial hypertension in transgenic mice. J. Exp. Med. 206, 2221-2234 (2009).
- Bearer, C., Emerson, R. K., ORiordan, M. A., Roitman, E., Shackleton, C. Maternal tobacco smoke exposure and persistent pulmonary hypertension of the newborn. Environ. Health Persp. , 105-202 (1997).
- Graham, B. B., et al. Schistosomiasis-induced experimental pulmonary hypertension: role of interleukin-13 signaling. Am. J. Pathol. 177, 1549-1561 (2010).
- Butrous, G., Ghofrani, H. A., Grimminger, F. Pulmonary vascular disease in the developing world. Circulation. 118, 1758-1766 (2008).
- Crosby, A., et al. Praziquantel reverses pulmonary hypertension and vascular remodeling in murine schistosomiasis. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 184, 467-473 (2011).
