Muskelfunksjon målinger bidra til vurdering av mulige legemiddelselskap for muskel patologi, så vel som til bestemmelse av mekanismene bak fysiologi av dette vevet. Vi vil demonstrere utarbeidelsen av extensor digitorum longus og membran muskler for funksjonell testing. Protokoller for isometrisk og eksentrisk sammentrekninger vil bli vist, så vel som forskjeller i resultater mellom dystrofiske muskler, som representerer en patologisk tilstand, og wildtype muskler.
Kritisk til evalueringen av potensielle terapi for muskelsykdom er sensitive og reproduserbar fysiske vurderinger av muskelfunksjonen. Fordi mange pre-kliniske studier er avhengige av musemodeller for disse sykdommene, har isolert muskel funksjon blitt en av standardene for go / NoGo vedtak i bevegelse narkotika kandidater frem i pasienter. Vi vil demonstrere utarbeidelsen av extensor digitorum longus (EDL) og membran muskler for funksjonell testing, som er de dominerende muskler benyttes for disse studiene. EDL muskel geometri er ideell for isolerte muskel forberedelser, med to lett tilgjengelige sener, og en liten størrelse som kan bli støttet av superfusjons i et badekar. Membranen viser dyp progressive patologi i dystrofiske dyr, og kan tjene som en plattform for å vurdere mange potensielle behandlinger motvirke fibrose, og fremme myofiber stabilitet. Protokoller for rutinemessig testing, inkludert isometrisk og eccenkraftforbruket sammentrekninger, vil bli vist. Isometrisk styrke gir vurdering av styrke, og eksentriske kontraksjoner bidra til å vurdere sarcolemma stabilitet, som er forstyrret i mange typer muskeldystrofier. Sammenligninger av de forventede resultatene mellom muskler fra wildtype og dystrofe muskler vil også bli gitt. Disse tiltak kan utfylle morfologiske og biokjemiske målinger av vev homeostase, samt hele dyr vurderinger av muskelfunksjon.
Muskelfunksjon målinger bidra til vurdering av mulige behandlinger for muskel patologi, så vel som til bestemmelse av mekanismene bak fysiologi av dette vevet. For muskel sykdom, har bruken av musemodeller blitt en sentral komponent for å forstå sammenhengen mellom genotype og fenotype, og for å utvide den kunnskapen til design og testing av potensielle legemiddelselskap. De muskeldystrofier, i særdeleshet, har vært avhengig av mus for å evaluere disse midlene og etablere pre-kliniske data som kreves for å gå videre til studier på pasienter. En hyppig effektmål bruker isolert muskel funksjon for å bestemme styrke, som er gjeldende for et bredt spekter av studier. Et annet tiltak er bruk av eksentriske, eller forlengelse, til sammentrekninger bestemme endringer i muskel membran integritet, noe som er mangelfull i Duchenne muskeldystrofi og musen modell for denne sykdommen (MDX). Derfor er det viktig for disse typer måling utenentene å være følsom og reproduserbar.
Musen strekkapparatet digitorum longus (EDL) muskel har blitt brukt i stor utstrekning for isolert muskelfunksjon grunnet sin ideelle geometri og størrelse, inkludert ensartet fiberorientering og definitive sener 2, 5, 6, 10, 12. Metoder for EDL muskler isometriske funksjonelle målinger er beskrevet i et tidligere Jove publikasjon 8, så vel som i den behand-NMD SOP 1. Vi har utvidet beskrivelse av disse metodene til å inkludere både isometrisk og eksentrisk sammentrekninger. Kjennetegnene på sykdommen er tydelig i EDL, inkludert heighted sykluser av degenerasjon / regenerering og redusert kraft produksjon.
Musen membran oppviser raskest patologisk progresjon av muskeldystrofi forhold til andre muskler i musen 11. Ved 6-måneders alder, består kumulativ fibrose ca 50% av muskelen. Dette resulterer i betydelig impaired force utgang 11. Derfor kan terapeutiske midler som kan forhindre fibrotisk infiltrasjon evalueres effektivt i mellomgulvet.
Tapet av dystrophin i muskel fører til økt sårbarhet og økt kontraktile skader i alle muskler 9. Derfor mange behandlingsformer for Duchenne muskeldystrofi er rettet for dystrophin erstatning. Som sådan, er en metode som har blitt viktig for å evaluere disse strategiene eksentriske sammentrekning, som kan skille mellom normalt og dystrofe muskel, samt bestemme hva nytte en bestemt strategi har for å beskytte en dystrofe muskel fra kontraktile skade 2, 3, 4, 12. Denne fremgangsmåten krever enten en dual-mode servo-motor som kan modulere / record lengde og kraft, eller en metode for å justere lengden raskt atskilt fra en kraft svinger.
Målet med denne artikkelen er å gi veiledning for å utføre isolerte muskel funksjon på to muskler fra mus – EDL og mellomgulvet. Evaluering av disse musklene kan gi innsikt i hvorvidt terapeutiske kandidater for muskel sykdom er gunstig. For både muskler, er den viktigste faktoren i å oppnå robuste data en ren disseksjon. Derfor øve og perfeksjonere den første isolasjon trinnet er viktig før han går videre til funksjonell testing. I tillegg etablere funksjonelle standarder for normal muskel er kritisk før du gjør sammenligninger til dystrofe muskel, eller mellom behandlingene. Dette vil sikre at de undersøkelsen er ikke gjenstand for høy variabilitet formidles av evnen av den personen som utfører forsøkene. Bruken av en membran impermeant fargestoff kan hjelpe med å optimalisere disseksjon forberedelse, for inkubering i alle muskler i en oppløsning inneholdende et slikt fargestoff vil markere mest ødelagte fibre, og kan tjene som en indeks av dissection suksess. Minimering av antall fibre skadet i muskel vil bidra til å optimalisere målingen. Fibrene skadet av disseksjon fluoresce mye klarere enn de skadet av eksentriske sammentrekning, og så hvis fargestoffet blir også brukt under mekanikk prosessen, kan man bruke intensiteten av fargestoff for å skille mellom de to typer skader.
Disseksjon av membran strimler vil nesten alltid ha fiber skade, rett og slett fordi ved å kutte langs lengden på fibrene, noen uunngåelig bli ødelagt. Dye opptak er sterk i de skadede fibre, og disse er normalt begrenset til de ytre kantene av preparatet. I gjennomsnitt, observerer vi et band av skadede fibre som er ~ 3 fibre i bredde (~ 120 mikrometer) på hver side av muskelen stripe. Hvis den skadede bandet består av mer enn 15% av muskelen, deretter blir dataene forkastet. Membranen forberedelse har også begrensninger på optimal størrelse for funksjonelle tiltak. Vi har funnet at stykker av diaphragm som er bredere enn 5 mm begynner å kaste opp på seg selv, fordi den sentrale sene slips er bare på ett punkt. Dette resulterer i redusert spesifikk kraft i preparatet. Vi har også funnet at smalere strimler har også lavere spesifikk kraft, som vi tror er fordi antall fibre skadet under disseksjonen omfatter en større andel av den totale fibermengde nummeret. For eksempel, hvis 0,1 mm på hver side er skadet, så det er 5% (2×0.1 mm / 4 mm remse) av muskel preparatet som ikke bidrar til å tvinge, mens hvis stripe er bare 1 mm, deretter 20 % av muskelen preparatet er skadet. Således, både bredden av den skadede regionen samt bredden av hele preparatet er viktige faktorer for å kontrollere.
Målinger av maksimal isometrisk spenning krever at alle muskelfibrene i en muskel stimuleres. Fordi det er enorm variabilitet i komponentene i en funksjon apparat, må dette bestemmes for hver individuelt settopp. For eksempel, kan bad størrelse eller type stimulator påvirke intensiteten av stimulering. Twitch stimulering er en rimelig måte å avgjøre supramaximal stimulering forhold. Når dette er etablert for en bestemt oppsett og muskel, kan det benyttes for påfølgende studier.
I kontrast, må den optimale lengden av en gitt muskelen som skal måles for hver preparat med iterativ prosess beskrevet ovenfor. Dette sikrer at tykke og tynne filament overlappingen er optimal og maksimal mulig kraft produksjonskapasitet måles. Alternative prosedyrer kan stole på diffraksjon mønstre knyttet til muskel striations, men dette krever ekstra utstyr som ikke er beskrevet her.
Vi rutinemessig bruker 500 msek stimulering varighet, som faller i det midtre området av denne parameteren brukes av andre forskere på dette feltet. Selv om dette kan føre til at noen utmatting av muskelen under kontraksjon, som er tydeligav en "sag" i maksimal kraft produksjon, kan dette i seg selv være informativ. For eksempel kan en forskjell i trøtthet oppnås ved ulike typer behandling, inklusive de som mål kalsium håndtering, derav sag i kraft i løpet aktiv kontraksjon kan tjene som en indeks for forbedring. Alternativt kunne tap av kraft indikerer at suturene på sener er ikke tett nok, og at de er forsinket under sammentrekning. Muskelen må fjernes fra badet og suturene må re-bundet hvis dette skjer. Vi bruker også en serie av 3 tetanic sammentrekninger, som bidrar evaluere stabiliteten av blandingen. Igjen, ville suture slips føre til tap av kraft mellom sammentrekninger, som krever sutur re-binding. Store muskler kan også generere anoksisk kjerner, noe som fører til tap av kraft i løpet av protokollen. Muskel størrelse er en begrensende faktor for å utføre isolerte muskel funksjon testing, der EDL muskler med massene større enn 20 mg miste kraft med hver kontraktørersjon, og kan ikke bli støttet av superfusjons i et bad. Membran strimler ikke lider av de samme komplikasjoner fordi de er tynne nok til å ha langvarig levedyktighet i badekaret.
Andre muskler kan utnyttes for isolert muskelfunksjon, inkludert soleus muskelen, som vanligvis brukes, men ikke beskrevet her. Mange av de samme prosedyrene kan bli vedtatt for soleus i form av forberedelse og funksjonell testing. Imidlertid de viktigste forskjellene er i stimulering frekvens, og parametrene for eksentriske sammentrekninger. Bruk av soleus for funksjon utfyller at av de to andre muskler, og så det bør vurderes som en del av en "standard pakke" for å vurdere dystrofiske mus 4, 7.
Eksentriske sammentrekning gir en indeks av kontraktile skjørhet, og det er viktig å bruke en protokoll som fører til beskjedne tap av kraft i muskler fra wildtype dyr og et betydelig tap av kraft iubehandlede dystrofiske musklene slik at det er et bredt dynamisk område for sammenligninger. En mangel på noen kraft tap i normale muskler antyder at den eksentriske sammentrekning er for mild, og vil ikke være tilstrekkelig til å skille mellom terapier som ikke er effektive, og de som er virkelig gunstig. Men et dramatisk tap av makt i normale muskler utsatt for eksentriske sammentrekning være for stor til å lokke ut forskjellene assosiert med sykdommen. Vår protokoll for EDL og membranen bruker en 0,5 Lo / sek stretch sats å produsere en 10% endringen i lengde. Vi utfører vanligvis fem eksentriske kontraksjoner, som resulterer i et lite tap av makt i normale muskler og et betydelig tap av kraft i dystrofiske muskler. Riktignok kan alle disse parametrene kan varieres for å øke den totale lengde endres, frekvensen av strekningen, eller antallet av eksentriske sammentrekninger for å skille mellom forskjeller sykt og sunn muskel, så vel som på virkningene av en bestemt type av mutasjon eller treatment man studerer. Så lenge det er en markant forskjell mellom normale og syke muskler, så er det en gullstandard for å strekke seg etter i form av behandlinger.
I sammendraget, etablerer denne protokollen retningslinjer for å utføre isometriske og eksentriske kontraksjoner, og forhåpentligvis identifiserer potensielle fallgruver du bør unngå når du setter denne teknikken opp i laboratoriet.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Paul D. Wellstone Cooperative Research Center (AR052646).
Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
in vitro Muscle Test System | Aurora Scientific | 1200A | |
Dissecting microscope | Leica | MZ6 | |
ACE light source | Schott-Fostec | A20500 | |
Dissecting scissors | Fine Science Tools | 14060-11 | |
Angled dissecting scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | alternate dissecting tool |
Curved scalpel blades #12 | Fine Science Tools | 10012-00 | alternate dissecting tool |
Bone scissors | Fine Science Tools | 16044-10 | |
S&T suture tying forceps | Fine Science Tools | 00272-13 | |
Dumont SS forceps – angled | Fine Science Tools | 11203-25 | |
Braided silk suture size 6-0 | Teleflex Medical | 07-30-10 | |
Medical tape | Transpore | 3M | |
Ketamine hydrochloride 100 mg/ml | Hospira | NDC 0409-2051-05 | Final Dose is 80 mg/kg |
TranquiVed Injection (xylazine 100 mg/ml) | Vedco | NDC 50989-234-11 | Final Dose is 10 mg/kg |
Reactive orange 14 | Sigma-Aldrich | R-8254 | |
Ringers Solution Components | Solution is gas equilibrated with 95% O2 and 5% CO2, final pH 7.4 | ||
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Final Concentration: 118 mM |
Potassium chloride | Fisher Scientific | P217-3 | Final Concentration: 4.7 mM |
Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | Final Concentration: 2.5 mM |
Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | P-285 | Final Concentration: 1.2 mM |
Magnesium sulfate | J.T. Baker | 2500-01 | Final Concentration: 0.57 mM |
4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) | Fisher Scientific | BP310-500 | Final Concentration: 5.95 g/L |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Final Concentration: 5.5 mM |