Muskelfunktion mätningar bidrar till utvärderingen av potentiella läkemedel för muskel patologi, samt fastställande av mekanismerna bakom fysiologi av denna vävnad. Vi kommer att visa utarbetandet av extensor digitorum longus och muskler membran för funktionstestning. Protokoll för isometriska och excentriska kontraktioner visas, liksom skillnader i resultat mellan dystrofa muskler, som representerar ett patologiskt tillstånd, och vildtyp muskler.
Avgörande för bedömningen av potentiella läkemedel för muskelsjukdom är känsliga och reproducerbara fysiologiska bedömningar av muskelfunktion. Eftersom många prekliniska studier är beroende av musmodeller för dessa sjukdomar har isolerad muskelfunktion blivit en av standarderna för Go / NoGo beslut att flytta läkemedelskandidater framåt i patienter. Vi kommer att visa utarbetandet av extensor digitorum longus (EDL) och muskler membran för funktionstestning, som är de dominerande muskler som används för dessa studier. EDL muskel geometri är idealisk för isolerade muskel preparat, med två lättåtkomliga senor, och en liten storlek som kan stödjas av superfusion i ett bad. Membranet uppvisar djup progressiv patologi i dystrofa djur och kan fungera som en plattform för att utvärdera många potentiella behandlingar att motverka fibros och främja myofiber stabilitet. Protokoll för rutinmässig testning, inklusive isometrisk och eccenTRIC sammandragningar, kommer att visas. Isometrisk styrka ger bedömning av styrka och excentriska kontraktioner hjälper att utvärdera sarcolemma stabilitet, vilket störs i många typer av muskeldystrofi. Jämförelser av de förväntade resultaten mellan muskler från vildtyp och dystrofisk muskler kommer också att ges. Dessa åtgärder kan komplettera morfologiska och biokemiska mätningar av vävnad homeostas samt hela bedömningar djur av muskelfunktion.
Muskelfunktion mätningar bidrar till utvärderingen av potentiella behandlingar för muskel patologi, samt fastställande av mekanismerna bakom fysiologi denna vävnad. För muskelsjukdom, har användningen av musmodeller blivit en central del för att förstå sambandet mellan genotyp och fenotyp, och för att utvidga den kunskapen i konstruktion och provning av potentiella läkemedel. De muskeldystrofi, i synnerhet, har förlitat sig på möss för att utvärdera dessa medel och etablera prekliniska data som krävs för att gå vidare till studier på patienter. Ett vanligt resultatmått använder isolerad muskelfunktion att bestämma styrka, som är tillämplig på ett brett spektrum av studier. En annan åtgärd är att använda excentriska, eller förlängning, för sammandragningar bestämma förändringar i muskel-membran integritet, vilket är bristfällig i Duchennes muskeldystrofi och mus modell för denna sjukdom (mdx). Därför är det viktigt att dessa typer av measuremföräldrar att vara lyhörda och reproducerbar.
Musen extensor digitorum longus (EDL) muskel har använts i stor utsträckning för isolerad muskelfunktion grund av dess ideal geometri och storlek, inklusive enhetlig fiberorientering och definitiva senor 2, 5, 6, 10, 12. Metoder för EDL muskler isometriska funktionella mätningar har beskrivits i en tidigare JUPITER publikation 8, liksom i behand-NMD SOP 1. Vi har utvidgat beskrivningen av dessa metoder för att inkludera både isometriska och excentriska sammandragningar. Kännetecken av sjukdomen är tydliga i EDL, inklusive heighted cykler av degenerering / regenerering och minskad kraft utgång.
Musen membran uppvisar den snabbaste patologiska utvecklingen av muskeldystrofi jämfört med andra muskler i musen 11. Genom 6 månaders ålder, omfattar kumulativ fibros ca 50% av muskeln. Detta resulterar i väsentligt impaired kraften ut 11. Därför kan terapeutiska medel som kan förhindra fibrotisk infiltrering utvärderas effektivt i membranet.
Förlusten av dystrofin i muskeln leder till ökad instabilitet och ökad kontraktila skador i alla muskler 9. Därför många behandlingar för Duchennes muskeldystrofi är inriktade för dystrofin ersättning. Som sådan är en analys som har blivit avgörande för att bedöma dessa strategier excentrisk kontraktion, vilket kan skilja mellan normal och dystrofisk muskler samt avgöra vad nytta en viss strategi har för att skydda en dystrofisk muskel från kontraktila skada 2, 3, 4, 12. Denna procedur kräver antingen en bimodal servomotor som kan modulera / postlängd och kraft, eller en metod för justering längd snabbt separat från en kraftomvandlare.
Målet med denna artikel är att ge vägledning för att utföra isolerad muskel funktion på två muskler från möss – EDL och membranet. Utvärdering av dessa muskler kan ge insikt om huruvida eller inte terapeutiska kandidater för muskelsjukdom är bra. För båda musklerna, är den viktigaste faktorn för att få säkra uppgifter en ren dissektion. Därför tränar och finslipa den ursprungliga isoleringen steget är viktigt innan du flyttar till funktionell testning. Dessutom fastställande funktionella riktmärken för normal muskel är avgörande innan du köper jämförelser dystrofisk muskel eller mellan behandlingarna. Detta kommer att försäkra att resultaten från studien är inte föremål för hög variabilitet förlänas genom förmågan hos den som utför experimenten. Användningen av ett membran ogenomträngligt färgämne kan hjälpa till med att optimera dissektion förberedelse, för inkubering av varje muskel i en lösning innehållande ett sådant färgämne kommer att markera mest skadade fibrer, och kan tjäna som ett index av dissection framgång. Minimera antalet fibrer skadade i muskeln kommer att bidra till att optimera mätningen. De fibrer som skadats av dissektion fluorescerar mycket starkare än de som skadats av excentrisk sammandragning, och så om färgämnet används också under processen mekanik, kan man använda intensiteten av färgämnet att skilja mellan de två typerna av skador.
Dissektion av membran band kommer nästan alltid fiberskada, helt enkelt eftersom genom att skära längs fibrerna, oundvikligen några få förstöras. Färgämnesupptagning är stark i de skadade fibrer, och dessa är normalt begränsade till de yttre kanterna av preparatet. I genomsnitt, observerar vi ett band av skadade fibrer som är ~ 3 fibrer i bredd (~ 120 | im) på vardera sidan om muskeln remsan. Om det skadade bandet innefattar mer än 15% av muskeln, då data tas bort. Membranet beredningen har också begränsningar för optimal storlek för funktionella åtgärder. Vi har funnit att bitar av diaphragm som är bredare än 5 mm börjar vika upp sig, eftersom den centrala senan slips är bara på en punkt. Detta resulterar i minskad specifik kraft i beredningen. Vi har också funnit att smalare band också har lägre specifik kraft, som vi tror beror på att antalet fibrer som skadats under dissektion omfattar en större andel av det totala fiberinnehållet nummer. Till exempel, om 0,1 mm på varje sida är skadad, så är 5% (2×0.1 mm / 4 mm remsa) av muskeln preparatet som inte bidrar att tvinga, medan om remsan är endast 1 mm, sedan 20 % av muskeln beredningen är skadad. Sålunda, både bredden av den skadade regionen samt bredden av hela beredningen är viktiga faktorer för att kontrollera.
Mätningar av maximal isometrisk spänning kräver att alla muskelfibrer i en muskel stimuleras. Eftersom det är en enorm variation i komponenterna i en funktion apparat måste detta fastställas för varje enskild uppsättningupp. Till exempel, kan bad storlek eller typ av stimulatorn påverka stimuleringens intensitet. Twitch stimulering är ett rimligt sätt att avgöra supramaximal stimulering förhållanden. När detta har bildats för en specifik inställning och muskler, kan den användas för efterföljande studier.
I motsats, måste den optimala längden av en given muskler som skall mätas för varje beredning med användning av iterativ process som beskrivits ovan. Detta säkerställer att tjocka och tunna filament överlappning är optimal och den maximala potentiella kraften produktionskapacitet mäts. Alternativa förfaranden kan lita på diffraktionsmönster associerade med muskel strimmor, men detta kräver ytterligare utrustning som inte beskrivs här.
Vi använder rutinmässigt 500 msek stimulering löptider, som infaller i mellanregistret av denna parameter som används av andra forskare inom detta område. Även om detta kan medföra en viss trötthet i muskeln under kontraktion, vilket är uppenbartav en "sag" i den maximala kraften produktionen kan detta i sig vara informativ. Till exempel skulle en skillnad i utmattning uppnås genom olika typer av behandlingar inklusive sådana som mål kalcium hantering därav sag i kraft under aktiv kontraktion kan fungera som ett index för förbättring. Alternativt kan förlusten av kraften indikerar att suturerna på senor är inte tillräckligt stram, och att de glider under kontraktion. Muskeln måste avlägsnas från badet och suturerna måste återupprättas bunden om detta inträffar. Vi använder också en serie av 3 tetanic sammandragningar, vilket hjälper till att utvärdera stabiliteten hos preparatet. Återigen skulle sutur glider leda till förlust av kraft mellan värkarna, kräver sutur nytt kopplingsförbehåll. Stora muskler kan också generera anoxiska kärnor, vilket leder till förlust av kraft under protokollet. Muskelmassa är en begränsande faktor för att utföra isolerad testning muskelfunktion, där EDL muskler med massor större än 20 mg förlorar kraft med varje entreprenörning, och kan inte stödjas av superfusion i ett bad. Membran band lider inte av samma komplikationer eftersom de är tunna nog att ha långvarig lönsamhet i badet.
Andra muskler kan användas för isolerad muskelfunktion, inklusive soleusmuskel, som vanligtvis används, men inte beskrivs här. Många av samma förfarande kan antas för soleus i fråga om förberedelser och funktionella tester. De största skillnaderna finns i stimulans frekvens och parametrar för excentriska sammandragningar. Användning av soleus för funktion kompletterar de andra två muskler, och det bör betraktas som en del av ett "standardpaket" för att utvärdera dystrofa möss 4, 7.
Excentrisk kontraktion ger ett index på kontraktila bräcklighet, och det är viktigt att använda ett protokoll som resulterar i måttlig förlust av kraft i musklerna från vildtyp djur och en betydande förlust av kraftobehandlade dystrofa muskler så att det finns ett brett dynamiskt omfång för jämförelser. Brist på någon kraft förlust i normala muskler tyder på att den excentriska sammandragning är alltför milt, och kommer inte vara tillräcklig för att skilja mellan behandlingar som inte är effektiva och de som verkligen är till nytta. Emellertid kan en dramatisk förlust av kraft i normala muskler utsätts för excentrisk kontraktion vara för stor för att retas ut skillnader i samband med sjukdomen. Vår protokoll för EDL och membranet använder en 0,5 Lo / sek sträckningshastighet att producera en 10% längd förändras. Vi utför vanligtvis 5 excentriska sammandragningar, vilket resulterar i en mindre förlust av kraft i normala muskler och en betydande förlust av kraft i dystrofa muskler. Visst kan alla dessa parametrar varieras för att öka den totala längden ändras, graden av sträckning, eller antalet excentriska kontraktioner för att skilja skillnader mellan sjuka och friska muskler samt om effekterna av en viss typ av mutation eller treatment en studerar. Så länge det finns en markant skillnad mellan normala och sjuka muskler, så finns det en guldmyntfot att nå för i form av behandlingar.
Sammanfattningsvis fastställer detta protokoll riktlinjer för att utföra isometriska och excentriska kontraktioner, och förhoppningsvis identifierar potentiella fallgropar att undvika när du denna teknik i din labb.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Paul D. Wellstone Cooperative Research Center (AR052646).
Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
in vitro Muscle Test System | Aurora Scientific | 1200A | |
Dissecting microscope | Leica | MZ6 | |
ACE light source | Schott-Fostec | A20500 | |
Dissecting scissors | Fine Science Tools | 14060-11 | |
Angled dissecting scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | alternate dissecting tool |
Curved scalpel blades #12 | Fine Science Tools | 10012-00 | alternate dissecting tool |
Bone scissors | Fine Science Tools | 16044-10 | |
S&T suture tying forceps | Fine Science Tools | 00272-13 | |
Dumont SS forceps – angled | Fine Science Tools | 11203-25 | |
Braided silk suture size 6-0 | Teleflex Medical | 07-30-10 | |
Medical tape | Transpore | 3M | |
Ketamine hydrochloride 100 mg/ml | Hospira | NDC 0409-2051-05 | Final Dose is 80 mg/kg |
TranquiVed Injection (xylazine 100 mg/ml) | Vedco | NDC 50989-234-11 | Final Dose is 10 mg/kg |
Reactive orange 14 | Sigma-Aldrich | R-8254 | |
Ringers Solution Components | Solution is gas equilibrated with 95% O2 and 5% CO2, final pH 7.4 | ||
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Final Concentration: 118 mM |
Potassium chloride | Fisher Scientific | P217-3 | Final Concentration: 4.7 mM |
Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | Final Concentration: 2.5 mM |
Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | P-285 | Final Concentration: 1.2 mM |
Magnesium sulfate | J.T. Baker | 2500-01 | Final Concentration: 0.57 mM |
4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) | Fisher Scientific | BP310-500 | Final Concentration: 5.95 g/L |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Final Concentration: 5.5 mM |