심장 조직 공학을위한 모세관 력 리소그래피
Summary
In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.
Abstract
심혈관 질환은 전세계 사망 1의 주요 원인이 남아있다. 심장 조직 공학 심장 재생뿐만 아니라 체외 심사 분석을위한 기능적인 조직 개발의 목표와 혁신적인 의료 발견을 제공하기 위해 많은 약속을 보유하고 있습니다. 그러나, 심장 조직의 충실도가 높은 모델을 만들 수있는 능력이 어려운 입증했다. 심장의 세포 외 기질 (ECM)는에서 나노 미터 규모의 2 마이크로에 이르기까지 모두 생화학 및 생 역학적 인 신호로 구성된 복잡한 구조입니다. 기계적 하중 조건과 세포 – ECM 상호 작용 지역은 최근 심장 조직 공학 3-5의 중요한 구성 요소로 인식되고있다.
심장 ECM의 많은 부분이 크게 조직 구조 및 전기 기계 결합이 영향을 나노 스케일 직경 정렬 콜라겐 섬유로 구성된다. 불행하게도, 몇 가지 방법이 근래전자 나노 미터 크기까지 ECM 섬유의 조직을 모방 할 수있게되었습니다. 나노 제조 기술의 최근 발전은, 그러나, 심장 6-9에서 ECM의 생체 구조 및 기판 강성 큐들을 모방 확장 발판의 설계 및 제조를 사용할 수있다.
여기에서 우리는의 발전을 제시이 재현성, 경제적, 및 생체 적합성 중합체, 폴리 (락 티드 – 코 – 글리콜 라이드) (PLGA) (8) 및 폴리 우레탄 (PU) 계 중합체를 사용하여 심장 세포의 기능적 정렬을위한 확장 가능한 나노 패터닝 공정. 이러한 이방를 nanofabricated 하층 (ANFS는) 잘 조직 된, 정렬 조직의 기본 ECM을 모방하고 세포 형태 및 기능을 10 ~ 14에 나노 형상의 역할을 조사 할 수 있습니다.
주형으로 나노 패턴 (NP) 실리콘 마스터를 사용하여, 폴리 우레탄 아크릴 레이트 (PUA) 금형을 제작한다. 이 PUA 몰드는 다음 파에 사용된다각각 UV-지원 또는 용매 매개 모세관 력 리소그래피 (CFL), 15, 16을 통해 PU 또는 PLGA 하이드로 겔을 ttern. 간단히, PU 또는 PLGA 예비 중합체는 유리 커버 슬립하고 PUA 금형이 상부에 배치되어 상으로 분배 된 드롭이다. UV 보조 CFL 들어, PU는 후 경화 UV 방사선 (λ = 250-400 NM)에 노출된다. 용매 매개 CFL의 경우, PLGA는 열 (120 ° C) 및 압력 (100 kPa의)를 사용하여 양각되어있다. 경화 후, PUA 몰드는 세포 배양을위한 ANFS 남기고 박리된다. 이러한 신생아 래트 심실 근세포뿐만 아니라 인간 다 능성 줄기 세포 유래 심근 같은 일차 전지는, ANFS 2에 유지 될 수있다.
Introduction
심혈관 질환은 세계에서 사망률 및 사망의 주요 원인이며, 이미 변형 된 세계 보건 시스템 1,17에 무거운 사회 경제적 부담을 제시한다. (1) 허혈성 질환이나 심근 병증 후 손상된 심근을 재생하거나 (2) 생체 외 약물 검사 또는 질병 모델링을위한 마음의 고 충실도 모델을 만드는 : 심장 조직 공학은 두 가지 목표를 가지고 있습니다.
심장은 몸에 혈액을 공급하기 위해 지속적으로 작동해야합니다 복잡한 기관이다. 심근 및 지원 조직의 밀집 층 구조는 심장 벽 (18, 19)에 걸쳐 나선형 패턴으로 배치되어있다. 심장은 전기 기계적 효율적으로 본체 (21)에 혈액을 배출 할 수있는 고도의 조정 방식으로 20에 연결된다. 자연의 아야 신뢰성 시험 관내에서 효과적으로 요약 될 수 있기 전에 여러 주요 장애물은, 그러나, 해결되어야 남아있다.강력한 심근 분화 방법 (22)을 개발하기 위해 계속하지만, 첫째, hPSC-CMS는 여전히 다소 미숙 표현형을 나타낸다. 자신의 전기 특성과 형태에 가장 가까운 태아의 수준 23 일치. 전통 문화의 조건에서 보관하는 경우 둘째, 줄기 세포 유래 및 기본 심근 모두 기본, 조직과 같은 구조로 조립하는 데 실패합니다. 오히려 세포가 무작위로 지향되고 성숙한 심근 (24)의 줄무늬 막대 모양의 외관을 지원하지 않는 경우가 있습니다.
세포가 상호 작용과 세포 외 기질 (ECM) 환경은 많은 세포 과정 11,13,25에 중요한 역할을한다. ECM은 크게 6,26 세포의 구조 및 기능에 영향을 미치는 복합, 잘 정의 된 분자 및 지형 큐들로 구성된다. 심장 내에서 세포 정렬 밀접 기본 나노 미터 규모의 ECM 섬유 2를 다음과 같습니다. 이러한 nanotopograph의 영향세포와 조직의 기능에 iCal의 단서는, 그러나, 지금까지 완전히 이해에 있습니다. 나노 미터 크기의 세포 – 생체 적합 물질의 상호 작용의 예비 연구 (27) 세포 신호 전달, 접착 28-30, 성장 31, 32, 33 및 차별화를위한 서브 마이크론 지형 신호의 잠재적 인 중요성과 효과를 나타냅니다. 그러나, 재현과 확장 성 나노 제조 기판 개발에 어려움에, 이러한 연구는 생체 내 ECM 환경에서 복잡한 멀티 스케일 휴대 효과를 재현 할 수 있습니다. 이 프로토콜에서, 네이티브 심장 ECM 섬유 배향을 흉내 낸 세포 배양 지지체를 생성하는 간단하고 비용 효과적인 나노 제조 기술은 심근 세포 – 생체 물질의 상호 작용의 신규 한 조사 광범위한 있도록 설명한다. 심근은 나노 ECM 환경과 상호 작용하는 방식을 이해하는 것은 더 가깝게 모방 기본 조직의 기능에 휴대 동작을 제어 할 수있는 능력을 허용 할 수기. 또한, 세포 단일 층은 3 차원 구조에 비해 단순화 된 실험 시스템입니다 만, 여전히 통찰력 조사와 기능 검사 2,34-36 복잡한 다세포 동작을 나타냅니다. 마지막으로, 지지체 (37)는 재생 목적을 위해 심장에 이식 할 때 셀룰러 그래프트 기능을 향상시키기 위해 사용될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
기능적으로 성숙한 심장 조직은 생체 내에서와 심장 조직 공학 생체 응용 프로그램에서 모두 부족하다. 여기에 설명 CFL의 나노 제조 방법은 셀룰러 정렬을 달성 인해 시스템의 확장 성으로 거시적 조직 기능을 좌우위한 견고한 기술이다. 큰 영역은 쉽게 패턴과 세포 배양에 사용할 수 있습니다. 매크로 셀 정렬은 생체 모방, 그것은 심근 (38)의 기계 및 전기 두 속성에 영향을 …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D. H. Kim thanks the Department of Bioengineering at the University of Washington for the new faculty startup fund. D. H. Kim is also supported by the Perkins Coie Award for Discovery, the Wallace H. Coulter Foundation Translational Research Partnership Award, the Washington State Life Science Discovery Fund, and the American Heart Association Scientist Development Grant (13SDG14560076). J. Macadangdang and A. Jiao thank the support from the NIH Bioengineering Cardiovascular Training Grant Fellowship. Additional support for this work comes from the National Institutes of Health (NIH) grant R01HL111197 to M. Regnier.
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Fibronectin | BD Biosciences | 354008 | |
| NOA 76 | Norland Products, Inc. | 7606B | |
| Surface Adhesion Promotor (Glass Primer) | Minuta Tech | ||
| PUA | Minuta Tech | MINS-311RM | |
| Soft Rubber Roller | Speedball | ||
| Silicon Wafers | NOVA Electronic Materials | FA01-9900 | |
| Photoresist | Shipley | SPRT510 | |
| Photoresist Developer | Shipley | MF320 | |
| Electron-Beam Lithography System | JEOL | JBX-9300FS | |
| Etching System | Surface Technology Systems | NP10 8UJ | |
| Plasma Asher System | BMR Technology Co. | DSF-200 | |
| Ozone Cure System | Minuta Tech | MT-UV-O- 08 | |
| Fusion Cure System | Minuta Tech | MT-UV-A 11 | |
| NOA 83H | Norland Products, Inc. | 8301 | |
| Spin Coater | Laurel Technology | WS-400-6NPP | |
| Skyrol PET Film | SKC Co., Ltd. | 23038-59-9 | |
| 25mm Glass Slides | Corning | 2948 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 6/5/2553 | |
| Poly(D,L-lactide-co-glycolide) | Sigma-Aldrich | P2191-1G | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 372978-1L | |
| 500g Weights | Global Insustrial | T9FB503120 | |
| Isopropyl Alcohol | EMD Millipore | PX1835-2 | |
| Hot Plate | Corning | PC-420D | |
| Sonicator | Branson | B2510MTH |
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